柑橘褐斑病[Alternaria alternata Fr.(Keissler)]是橘类及其杂交柑橘上最重要的病害之一,为害嫩叶、嫩梢及果实,引起落叶、枯梢和落果,对柑橘生产构成严重威胁。已有研究表明,褐斑病菌的侵染可诱导寄主活性氧喷发和脂质过氧化,而抗氧化胁迫能力下降将导致柑橘褐斑病菌致病力严重下降或丧失。在酿酒酵母中,硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统在氧化胁迫的清除、生长发育及DNA的稳定性等方面发挥重要作用,但鲜有关于丝状真菌硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统的系统性研究报道。此外,组蛋白乙酰化修饰对于调节真核生物细胞染色体结构、基因转录、多种胁迫应答及生长发育等生物学进程至关重要。在众多植物病原真菌中,组蛋白乙酰基转移酶(如Gcn5)或去乙酰化酶(如Hos2)的缺失往往也会引起相应病原真菌抗氧化能力及致病力的显著下降。然而,硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统相关基因的研究在链格孢菌中相对较少,而组蛋白乙酰基转移酶与去乙酰化酶家族基因的系统性功能分析在该类真菌中更无人报道。因此,本研究通过基因敲除与回补,分子生物学,转录组学及基因组学等手段,对柑橘褐斑病菌中硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统相关基因,组蛋白乙酰基转移酶与去乙酰化酶家族相关基因进行系统性敲除并开展了相关基因的生物学功能研究。主要研究内容与结果如下:一、硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统基因功能分析硫氧还蛋白过氧化物酶(Tsa1)与硫氧还蛋白还原酶(Trr1),谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx3)与谷胱甘肽还原酶(Glr1)分别是调控硫氧还蛋白与谷胱甘肽氧化还原稳态的氧化酶与还原酶,而谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)和谷胱甘肽合成酶(Gsh2)则是生物体谷胱甘肽合成所必需的两个酶。在酿酒酵母中,Tsa1、Trr1、Gpx3、Glr1、Gsh1和Gsh2的敲除均导致其清除外界氧化胁迫能力削弱。Tsa1、Trr1、Gpx3、Glr1、Gsh1和Gsh2的转录水平在柑橘褐斑病菌中均受氧化物诱导上调。Trr1和Glr1是柑橘褐斑病菌营养生长和产孢过程中的重要基因,它们的缺失将导致该病原菌生长发育及产孢能力严重受损。在培养基中添加外源谷胱甘肽能够使得Trr1和Glr1缺失突变体的营养生长和产孢能力恢复。Tsa1、Trr1与Glr1的敲除突变体在氧化胁迫条件下营养生长受到严重抑制,同时致病力显著下降或丧失。Gsh1和Gsh2的缺失导致柑橘褐斑病菌营养生长受到极严重抑制,同时抗氧化能力严重下降。此外,Trr1和Glr1有助于柑橘褐斑病菌适应NaCl造成的盐胁迫。Glr1还是柑橘褐斑病菌适应渗透胁迫、代森锰锌及啶酰菌胺的重要基因。Trr1参与了啶酰菌胺和百菌清的抗性反应。Tsa1则对上述三种杀菌剂均无响应。荧光定量分析结果显示,Tsa1和Trr1的转录受氧化胁迫调控因子Ap1、Hog1和Skn7调控。研究结果表明,硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统相关基因对于柑橘褐斑病菌适应活性氧胁迫至关重要,并对该病原菌的生长发育和致病力产生重要影响。二、组蛋白乙酰基转移酶与去乙酰化酶功能分析组蛋白乙酰化是表观遗传学主要的调控方式之一,在调控染色体的解聚、基因的转录及蛋白功能等方面发挥重要作用。本研究在柑橘褐斑病菌中共鉴定出Gcn5、RTT109、Elp3、Sas3、Sas2、Nat3和Esa1 7个组蛋白乙酰基转移酶基因和Hos2、Rpd3、Hda1、Hos3、Hst2和Sir2 6个组蛋白去乙酰化酶基因。这13个基因在不同真菌间相对保守。染色体定位分析结果显示这13个基因全部位于柑橘褐斑病菌的必需染色体中。通过基因敲除,共获得柑橘褐斑病菌6个组蛋白乙酰基转移酶与6个去乙酰化酶的单基因敲除突变体。与野生型相比,5个组蛋白乙酰基转移酶和2个组蛋白去乙酰化酶的基因缺失突变体营养生长受到显著抑制。致病力检测结果表明,Gcn5、Sas3和Nat3缺失突变体的致病力完全丧失,RTT109,Elp3,Hos2和Rpd3缺失突变体的致病力显著下降,Sas2,Hda1,Hos3,Hst2和Sir2缺失突变体的致病力没有发生显著变化。显微观察发现,Sas3、RTT109、Nat3、Hos2和Rpd3缺失突变体的产孢量显著下降,Sas2、Elp3、Hda1、Hos3、Hst2和Sir2则并未在褐斑病菌的产孢过程中发挥显著性作用。Gcn5缺失突变体产孢能力完全丧失,同时菌丝节间缩短,菌丝细胞肿大畸形。各项胁迫实验结果表明,Gcn5、Sas3和Hos2在柑橘褐斑病菌适应氧化胁迫、细胞壁干扰剂、渗透胁迫及饥饿胁迫等方面发挥重要作用。Gcn5、Sas3和Hos2的缺失还导致柑橘褐斑病菌对碳源的利用能力产生缺陷。转录组分析结果表明,Gcn5和Hos2对能量产生、碳源代谢、DNA损伤修复、抗氧化、细胞自噬、泛素降解及内质网膜上蛋白加工等通路相关基因的转录具有调节作用。此外,Gcn5、Hos2及RTT109缺失突变体对羟基脲、甲磺酸甲酯或喜树碱等DNA损伤诱导剂敏感性显著上升。基因组重测序数据分析结果表明Gcn5在修复紫外照射所产生的DNA损伤方面发挥重要作用。本研究揭示了组蛋白乙酰基转移酶与去乙酰化酶对柑橘褐斑病菌的营养生长、产孢、致病、多种胁迫抗性、碳源利用及DNA损伤修复等诸多生物学功能具有重要的调控作用。以上研究证明硫氧还蛋白与谷氧还蛋白系统及组蛋白乙酰化修饰家族基因对柑橘褐斑病菌的生长发育、多种胁迫响应及杀菌剂抗性等诸多生物学功能均至关重要,显示次级抗氧化系统、组蛋白乙酰化修饰与柑橘褐斑病菌致病性之间存在紧密联系,为进一步开展相关方面的分子生物学研究提供基础。