菌胁迫下厚壳贻贝TLR-i基因表达及其对下游信号通路基因表达的影响

来源 :浙江海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:btly540205390
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伴随着我国沿海城市工业化不断推进,日常生活废物持续污染,近海养殖业遭受了越来越频繁的病菌侵害,多种海洋经济物种生存环境愈发严峻。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国东南沿海各省的养殖贝类之一,由于成年个体底栖固着的滤食性生活方式,成为了众多海洋病原菌的理想宿主,而海洋弧菌就是其中一大主要病原菌。先天免疫在厚壳贻贝免疫系统中占据重要地位,而Toll样受体是先天免疫中的一环。因此,本实验以厚壳贻贝Toll样受体为研究对象,通过同源克隆法及RACE技术得到厚壳贻贝Toll样受体i(McTLR-i)的cDNA全长以及溶菌酶cDNA序列McLYZ,采用荧光定量PCR(real-time fluorescence quantification,RT-qPCR)初步探究McTLR-i、参与TLR/NF-kB通路的接头分子和McLYZ的相对表达趋势是否存在联系,主要实验结果如下:(1)McTLR-i cDNA序列全长为2821bp,其中包含2022bp的开放阅读框,编码673个氨基酸,结构域分析显示其与软体动物的mccTLRs较为相似。McTLR-i与地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)TLR-i氨基酸序列相似性高达90.64%。多序列比对结果显示,McTLR-i与其他贝类TLRs在胞外区的保守性低,跨膜区和胞内区TIR结构域则较为相似。其TIR结构域存在保守基序BOX1和BOX3,但BOX2缺失。系统进化树显示,McTLR-i与mccTLRs聚类,且与地中海紫贻贝MgTLR-i位于同一分支。(2)组织差异性表达显示,McTLR-i在鳃组织中最高。经副溶血弧菌感染后,McTLR-i于2h即出现表达峰,约为对照的10.27倍;溶藻弧菌刺激下,在8h出现表达峰,约为对照的7.09倍,确认McTLR-i参与了厚壳贻贝对两种弧菌的免疫应答。实验选取TLR/NF-κB通路中8个cDNA片段(MyD88a、IRAK-b、IRAK-a、TRAF-6、TAK-1、TAB3、IKK-a和Rel)检测菌感染下的表达趋势,结果分析发现其时序表达与McTLR-i不完全吻合,推测可能因为免疫信号的传导存在一定时间间隔,也可能是TIR结构域中BOX2的缺失影响了McTLR-i对下游通路的激活,其原因仍需进一步实验验证。(3)克隆得到McLYZ cDNA全长为691bp,开放阅读框为564bp,编码187个氨基酸。结构域预测和多序列比对分析显示,McLYZ有一个保守的失稳酶结构域,其中包含两个与催化功能密切相关的位点Glu83和Asp95以及一个被认为具有异肽酶活性的His159。McLYZ与紫贻贝(Mytilus edulis)LYZ相似性为86.63%。分子特性预测暗示,McLYZ可能在厚壳贻贝免疫系统和消化系统中均发挥一定作用。蛋白三维结构建模结果显示三个功能位点空间位置接近,暗示其功能上有相互关联的可能。(4)McLYZ组织差异结果显示,其在肝胰腺表达量最高。在肝胰腺中,副溶血弧菌注射后,McLYZ于24h达到表达峰,随后下降;嗜水气单胞菌注射后,McLYZ于48h出现峰值。鳃组织中,副溶血弧菌注射后,McLYZ只于24h出现显著表达;而在嗜水气单胞菌注射后,McLYZ于2h即出现表达上调,4h达到表达峰。上述结果说明McLYZ参与对弧菌的免疫防御,但鳃中McLYZ的时序表达与McTLR-i的表达趋势不相似,无法确切判断McTLR-i是否通过TLR/NF-κB通路进行免疫信号传导,进而促使McLYZ的生成,相关性还需进一步研究。上述结果表明,McTLR-i在厚壳贻贝抗菌感染中发挥了作用,并有可能参与TLR/NF-κB信号通路。McLYZ作为厚壳贻贝体内的免疫分子同样在先天免疫过程中扮演着一定的角色,其与上述TLR/NF-κB信号通路的关联有待于后续研究探明。
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