研究背景Graves眼病(Graves ophthalmopathy, GO)是Graves病最常见的甲状腺外表现,目前被认为是一种器官特异的自身免疫性疾病。在1853年的文献中,罗伯特·詹姆斯·格雷夫斯第一个报道突眼症状与甲状腺疾病的关联¨,并且认为眼病可能会出现在甲状腺疾病发病之前、之中或明显甲状腺疾病发病后,通常有一个缓慢起病的过程。其眼部表现具有显著的特征：轻者仅有眼部不适、眼睑退缩,重者出现畏光、流泪、突眼、复视,甚至视力减退、丧失。Gerding等曾对这些患者的生活质量进行评估,结果表明他们的机体功能、社交能力、心理健康、躯体痛楚、健康感觉等方面都受到严重影响,临床治疗也存在一定的困难[2]。该病的组织病理学特征是病变早期眼外肌的肌内膜有淋巴细胞浸润,激活成纤维细胞,产生胶原并分泌亲水性的糖胺聚糖(GAG),导致眼肌肿大、复视、运动受限、视神经受压。随着病程进展,间质广泛纤维化,肌细胞受损,眼球固定。球后结缔组织和脂肪以及泪腺出现与肌肉间质类似的改变,眶内容物增多导致突眼。眼轮匝肌肌纤维间GAG增多,水分潴留,引起眼睑肿胀。提上睑肌肥大、变性和纤维结缔组织增生引起了上睑的退缩和迟落。目前认为其具体的发病机制仍不是十分明确。现在的观点认为：Graves眼病的发病是一种多基因遗传、多因素作用参与的T细胞免疫介导性疾病,研究表明,CD4+的T淋巴细胞通过识别甲状腺、眶内组织及眼球外的自身抗原并与其受体相结合而被激活,产生各种细胞因子和黏附分子,最终产生各种自身抗体,参与GO发病。因此CD4+淋巴细胞免疫功能异常在Graves眼病的发病机制中非常重要。CD4+T淋巴细胞(辅助性T淋巴细胞)被认为是体液免疫、细胞免疫及细胞因子调节的中心,主要分为Th1、Th2细胞亚群。既往已有大量研究针对Th1/Th2细胞之间的平衡以及相关的细胞因子在自身免疫性疾病中的作用,但是研究发现其并不能很好的解释Graves眼病等自身免疫性疾病发病的机制。Treg/Th17细胞是近几年研究发现的非常重要的CD4+的细胞亚群,CD4+CD25+Foxp3+Treg(即调节性T细胞)是一类具有免疫抑制作用的T细胞,是T细胞调节免疫系统的一个亚群,已有的研究显示,Treg是机体免疫应答中起调控作用的一类T淋巴细胞,可通过影响其他T细胞和抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)的活性,导致细胞因子产生和分泌的抑制,减少共刺激分子和黏附分子的表达,某些情况下通过促进细胞死亡清除活化免疫细胞来发挥作用。目前很多研究认为其在维持自身免疫功能的稳定发挥重要的作用,并减少自身免疫性疾病的发生。小鼠模型表明,调节性T细胞的调节可以治疗自身免疫性疾病和癌症,并促进器官移植。而Th17细胞为近年来发现的具有很强的促炎作用的一类细胞,这类细胞主要以分泌IL-17(IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子为特征,其增殖、分化过程需要IL-6和TGF-p的参与,并且需要STAT3依赖性的转录因子RORymRNA的表达。目前研究认为在自身免疫性疾病及抑制排斥反应的炎症中均有其参与。Treg/Th17之间通过相关的细胞因子产生相互作用,Treg/Th17的平衡在免疫调节过程中发挥重要作用,目前已经在自身免疫性疾病中得到越来越多的关注,正是如此本研究探讨Treg/Th17细胞及相关细胞因子在Graves眼病中的作用。本研究拟通过观察Treg细胞及Th17细胞在Graves眼病患者外周血中的比例及相关细胞因子、特异性转录因子的表达,并评估其与Graves眼病临床相关性及意义,来探讨Treg细胞及Th17细胞在Graves眼病发病机制中的可能作用,同时探讨Treg/Thl7的平衡对Graves眼病的影响。第一章Graves眼病患者外周血中Treg/Th17细胞及相关细胞因子的表达及可能作用机制目的通过检测Graves眼病患者外周血中的Treg/Th17细胞及相关细胞因子TGF-β、IL-10、IL-35、IL-17A、IL-23、IL-6的表达水平,观察Graves病与Graves眼病不同期患者之间及与正常人之间Treg/Th17细胞及相关细胞因子表达的差异,探讨Treg/Th17细胞在Graves病发病中的可能作用机制。方法1)连续收集未行大剂量激素冲击及其他免疫抑制剂治疗的Graves眼病患者30例,按临床活动性评分(clinical activity score, CAS)将其分为活动期(AGO组)15例(CAS>3)和稳定期(NGO组)15例(CAS<3)；同期连续收集初诊Graves病患者15例(GD组)及健康志愿者15例(C组)。2)收集各组病人外周静脉血,流式细胞计数检测四组患者外周血中Treg、Thl7细胞比例的变化；使用双抗体夹心酶免疫吸附法(ELISA)检测血清中Treg细胞相关因子(TGF-β、IL-10、IL-35)、Th17细胞相关细胞因子(IL-17A、IL-23、IL-6)的表达变化,并分别与CAS评分、FT3、FT4、TSH、TRAb、突眼度等临床或实验室指标进行相关性分析。3)统计学分析方法：采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD-t检验;方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’sT3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布的资料用Spearman等级相关分析。以a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1)流式细胞计数：检测Treg细胞比例,GD组(1.61±0.15)、NGO组(1.66±0.13)、AGO组(1.59±0.11)中Treg细胞比例较C组(1.72±0.24)稍下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。AGO组较NGO组、GD组下降,差异无统计学意义(P>0.05)。GD组较NGO组升高,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者Treg细胞表达水平与临床活动性评分(CAS)、FT3. FT4、TSH、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。检测Th17细胞比例,GO组(1.62±0.19、1.21±0.10)、GD组(1.17±0.13)较正常组C组(0.61±0.08)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。AGO组(1.62±0.19)较NGO组(1.21±0.10)、GD组(1.17±0.13)升高,差异有统计学意义(P<0.05)。但是GD组与NGO组差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者Thl7细胞表达水平与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与FT3、FT4、TSH、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。2)ELISA检测：ELISA检测结果显示Treg细胞相关的功能蛋白TGF-β在AGO组(4.68±0.33)、NGO组(7.71±0.63)、GD组(8.32±0.52)表达较正常组C组(15.31±0.71)均下降(P<0.05),在AGO组中下降最明显(P<0.05,F=162.98)。AGO组表达低于NGO组(P<0.05)。NGO组表达稍低于GD组,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-35蛋白在AGO组(0.34±0.07)、NGO组(0.79±0.09)、GD组(0.87±0.12)表达与C组(1.46±0.17)相比,有不同程度的下降(P>0.05),且在AGO组中下降最明显(P<0.01, F=17.64)。 AGO组表达低于NGO组(P<0.05)。NGO组表达稍低于GD组,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-10在C组(2.37±0.31)中少量表达,在AGO组(20.54±2.69)、NGO组(22.63±2.73)、GD组(21.48±3.32)中表达均有不同程度的增加(P<0.05,F=403.15),且三者之间升高的差异无统计学意义。相关性检验分析显示GO组患者TGF-β、IL-35、IL-10表达水平与临床活动性评分(CAS)、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。Th17细胞分泌的IL-17A在正常组C组(6.27±0.84pg/m1)中少量的表达,在NGO组(11.78±1.43)、GD组(11.34±0.68)中表达增加(P<0.05),而在AGO组(15.42±1.19)中表达明显增加(P<0.05, F=274.56)。 AGO组表达高于NGO组(P<0.05)。NGO组较GD组稍升高,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-6在AGO组(19.42±1.19)、NGO组(12.61±1.73)、GD组(13.24±1.57)较C组(5.41±0.87)均有明显的升高(P<0.05),AGO组升高最明显(P<0.05, F=261.28)。AGO组表达高于NGO组(P<0.05)。NGO组较GD组稍下降,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-23在NGO组(45.71±5.73)、GD组(41.63±3.52)中表达较C组(20.25±1.89)明显增加(P<0.05), AGO组(63.28±7.53)增加最为明显(P<0.01,F=367.56)。AGO组表达高于NGO组(P<0.05)。NGO组较GD组稍升高,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者IL-17A、IL-6、IL-23表达水平与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。结论Treg细胞比例在GO组、GD组、C组中表达虽然无明显的变化,但是其相关的功能分子TGF-p、IL-35在GO组、GD组均有下降,且在AGO组中下降最明显,表明Treg细胞免疫抑制功能的降低可能是促使Graves眼病发生的一个重要因素。Th17细胞比例及相关功能分子IL-17A、IL-23、IL-6的表达在AGO组、NGO组、GD组中均较C组升高,且在AGO组中升高最明显,并与临床活动性评分(CAS)呈正相关,说明Th17细胞可能在介导Graves眼病发生及发展中起着相当重要的作用,Th17细胞及相关细胞因子可能是评估GO患者病情活动性的新指标。第二章Graves眼病患者外周血Treg/Th17细胞特异性转录因子Foxp3mRNA、RORymRNA的表达及可能作用机制目的通过检测Graves眼病患者外周血中的Treg/Th17细胞的特异性转录因子Foxp3mRNA、RORymRNA的表达水平,观察Graves病不同时期患者之间及与正常人Foxp3mRNA、RORγmRNA表达的差异,进一步探讨Treg/Th17细胞在Graves眼病发病机制中的作用。方法1)连续收集未行大剂量激素冲击及其他免疫抑制剂治疗的Graves眼病患者30例,按临床活动性评分(clinical activity score, CAS)将其分为活动期(AGO组)15例(CAS≥3)和稳定期(NGO组)15例(CAS<3)；同期连续收集初诊Graves病患者15例(GD组)及健康志愿者15例(C组)。2)收集各组病人外周静脉血,采用荧光定量PCR(RT-PCR)检测Treg/Th17细胞的特异性转录因子Foxp3mRNA、RORymRNA在四组中的表达情况,并分别与CAS评分、FT3、FT4、TSH、TRAb、突眼度等指标进行相关性分析。3)统计学分析方法：采用SPSS16.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett sT3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布的资料用Spearman等级相关分析。以a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。结果荧光定量PCR检测：RT-PCR结果显示Treg特异性转录因子Foxp3mRNA在四组即AGO组(1.50±0.14)、NGO组(1.48±0.13)、GD组(1.44±0.12)、C组(1.53±0.09)中未见明显表达变化,各组之间差异不具有统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者Foxp3mRNA表达水平与临床活动性评分(CAS)、FT3、FT4、TSH、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。Th17特异性转录因子RORymRNA在AGO组(1.95±0.14)、NGO组(1.41±0.13)、GD组(1.38±0.16)中表达较C组(0.67±0.21)均明显升高(P<0.05),其中AGO组(1.95±0.14)升高最明显(P<0.01)。AGO组表达高于NGO组(P<0.05)。NGO组较GD组稍升高,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者RORymRNA表达水平与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与FT3、FT4、TSH、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。结论GO组患者外周血中RORymRNA表达水平较正常组升高,且活动期患者高于稳定期患者,并与临床活动性评分(CAS)呈正相关,提示RORymRNA的上调与GO的发生发展有关,也进一步说明Th17细胞参与GO的发病。