论文部分内容阅读
背景及目的乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤。据估计全球每年新增女性乳腺癌患者近130万,且每年超过45万人死于乳腺癌。作为对化疗比较敏感的实体瘤之一,化疗是其不可替代的治疗手段,然而近1/4的乳腺癌病人会出现对药物耐药,并且会对多种结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药,即多药物耐药(multi-drug resistance,MDR)。化疗耐药一直是导致多种恶性肿瘤治疗失败的关键因素,也是临床医学工作者彻底根治肿瘤首要解决的问题。乳腺癌耐药机制研究一直是热点领域,同时更是乳腺癌化疗效果难以突破的难点,其产生过程复杂多变。迄今为止,其耐药机制尚未完全阐明,因此缺乏有效的逆转耐药的治疗策略,这不仅严重威胁人类健康,也给家庭和社会造成沉重的经济负担和精神负担。目前,DNA芯片技术虽然能给出生物体所启动基因的相关信息,但它并不能反映蛋白质合成的情况,即mRNA的种类和含量并不能反映蛋白质的表达水平。由于生命活动的实际真正执行者是动态变化的蛋白质,而不是相对静止的基因,尤其由于蛋白质的种类繁多,在不同的病理状态下蛋白质组成不同;同时各种蛋白质之间又存在相互作用而构成一个复杂而庞大的网络体系,因此研究蛋白质对解释肿瘤的耐药性更具有实际意义,有必要运用蛋白质组学技术从蛋白质整体水平来揭示肿瘤MDR的本质,阐明其详细的分子机制。本研究利用最新的串联质谱标签定量方法,以研究乳腺癌细胞耐药机制较为理想的细胞模型——乳腺癌阿霉素敏感型细胞株(MCF-7)和耐药细胞株(MCF-7/ADM)为对象,应用蛋白质组学研究手段探索乳腺癌的MDR机制和潜在的治疗靶点,期望能为乳腺癌的逆转耐药和靶向治疗提供线索和有价值的理论依据。方法本研究通过基于质谱技术的蛋白质组学串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量方法,以Thermo Scientific Q Exactive台式液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)为研究平台,将高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AM)Orbitrap检测技术相结合,以MCF-7和MCF-7/ADM为研究对象,利用先进的高通量蛋白质组的研究方法鉴别可能与耐药相关的候选蛋白,寻找耐药相关的潜在标志物,进而应用生物信息学手段和抗体抗原反应技术,验证和预测候选蛋白是否与耐药相关,尽可能获得全面生物学信息,构建乳腺癌耐药蛋白质谱。利用蛋白互做网络全面揭示可能与乳腺癌耐药相关的靶标蛋白和传导通路,综合分析其临床价值,为逆转耐药以及靶向治疗提供有价值的理论依据。结果质谱鉴定出了719个蛋白质可用于差异定量分析,设定不同样品质谱峰强度比值为1.5和0.67为TMT差异表达蛋白质的上、下调阈值。根据阈值在MCF-7和MCF-7/ADM细胞株间鉴定出80个蛋白质的表达水平存在显著差异,其中,与MCF-7细胞株相比较,49个蛋白质在MCF-7/ADM细胞株中高表达,31种蛋白在MCF-7/ADM细胞株中低表达。这些蛋白质为进一步识别耐药相关靶标分子提供了重要信息。应用生物信息学技术参照蛋白质数据库(Uniprot),结合Proteome Discoverer?(PD)软件和DAVID平台,针对80个差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)进行功能富集和验证。通过KEGG富集通路方法发现6种信号通路,其中谷胱甘肽代谢通路,磷酸戊糖通路等与乳腺癌耐药明显相关,富集到谷胱甘肽代谢通路的5个差异表达蛋白质,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)与谷胱甘肽S-转移酶pi 1(glutathione S-transferase pi 1,GSTP1)已被报道与乳腺癌耐药相关,γ-谷氨酰环化转移酶(gamma-glutamyl cyclotransferase,GGCT),异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)和异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)为本研究首次报道与肿瘤耐药相关,通过Western Blot进一步验证分析,结果显示5个差异表达蛋白均与质谱获得结果相一致,同时GGCT、IDH1和IDH2作为新鉴定的耐药相关靶标蛋白具有良好的临床应用价值。本研究采用人类蛋白质参考资源数据库(HPRD)现有的蛋白质互作网络,利用MINE、Cytoscape等方法对筛出的与乳腺癌耐药高度相关的80个DEPs数据进行检索和挖掘,然后系统全面的进行生物信息学分析和蛋白相互作用网络图谱分析,深层次地验证高通量的质谱分析的结果。结果显示80个差异表达蛋白中,共有66个差异蛋白富集到网络中,遂以此66个差异蛋白作为种子蛋白构建蛋白质一步互作网络,共获得493个一步互作蛋白,经过文献挖掘和校对,97%的差异蛋白与耐药直接和间接相关。结论本研究首次在MCF-7和MCF-7/ADM细胞系中,联合TMT定量技术和Q Exactive质谱技术,鉴定到谷胱甘肽通路上的5个DEPs(GGCT、G6PD、IDH1、IDH2和GSTP1)与耐药相关,其中GGCT、IDH1和IDH2是首次报道与耐药相关的蛋白。此外利用生物信息学方法对DEPs、一步互作蛋白质以及重要的信号通路构建了乳腺癌耐药蛋白质谱,并进行了深入分析,结果显示基于质谱技术开展的蛋白质组学方法所获得的97%DEPs与耐药相关,侧面反映了蛋白组学数据的高可信性和质谱技术的精确性以及可推广性,这为将来的临床转化治疗提供重要的理论依据。