鸭呼肠孤病毒病是由鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus，DRV)引起的以脾表面出现黄白色坏死灶，法氏囊萎缩为主要特征的一种急性传染病，该病毒可感染雏鸭和鸡，继发感染其他病原引起动物死亡，给养殖业带来较大的经济损失。目前关于哺乳动物脾损伤的机制研究已逐步深入，研究结果表明PKR在各种损伤过程中发挥着重要作用。但是关于鸭PKR介导的炎症反应还未见报道，且是否参与DRV引起脾损伤的进程还不清楚。因此研究PKR在脾损伤中的作用是很有必要的。本研究通过建立人工感染模型，探讨PKR介导的炎症信号通路在DRV感染雏鸭致脾损伤中的作用。主要包括以下几个方面:　　1.DuTNF-α多克隆抗体的制备　　本实验以雏鸭脾组织的RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增DuTNF-α基因，克隆至pET-28a载体上，经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定测序分析正确后，获得重组质粒pET-28a-DuTNF-α，转化至大肠杆菌Rosetta中，在IPTG终浓度1mmol/L和37℃条件下诱导4h，外源基因获得高效表达。通过Ni柱对蛋白进行纯化，纯化后的DuTNF-α蛋白免疫新西兰大耳白兔，经三次免疫后取全血，分离得到DuTNF-α多克隆抗体。利用Elisa和免疫组织化学染色检测结果表明多克隆抗体有较好的反应原性。　　2.建立DRV感染7日龄樱桃谷鸭模型　　分别在雏鸭感染后1d、3d、5d、7d、14d剖杀取脾组织。从组织形态学判定脾损伤程度，采用组织病理学及免疫组织化学判定炎症反应的产生。利用RT-qPCR技术检测感染后脾中PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达量的动态变化，并分别取5个时间点实验组和对照组的脾脏石蜡切片，每组各取三个重复样品进行免疫组化，使用数字切片扫描仪将切片扫描，使用单位面积阳性率进行结果分析。　　眼观病变发现，感染后1d、3d脾显著肿大，颜色逐渐加深，部分病灶呈暗黑色，感染5d后脾颜色恢复正常，脾表明可见明显大小不一的黄白色病灶。组织病理学观察结果发现感染后3d脾出血严重，白髓淋巴细胞明显减少，感染后5d脾脏可见明显的坏死灶，坏死灶与周围健康细胞分界明显，感染7d后可见明显的肉芽肿结构。根据Opriessning T的评定标准对脾组织学病理损伤进行评定发现感染3d后出血严重，感染5d后发生坏死，感染7d后形成肉芽肿结构。用DRV特异性抗体及炎症细胞特异性抗体进行免疫组织化学染色，证明脾产生严重的炎症反应。荧光定量检测脾中PKR介导的炎症信号通路相关因子的表达量，结果显示PKR在感染后1d、3d、5d处于上调表达，且5d达到峰值，7d、14d与5d试验组相比差异显著(P＜0.05)，这与病毒的表达量呈正相关，说明PKR可能参与dsRNA的识别，从而激活下游因子引起脾脏损伤。MKK6、AP-1、IPS-1在感染过程中均无上调表达，而NF-κB在整个感染过程中一直处于上调表达。可见在DRV感染雏鸭后PKR参与病毒的识别，并激活NF-κB入核启动转录相关因子。下游炎症因子TNF-α表达趋势与NF-κB一致，IL-6在感染3d后上调表达，到7d达到峰值，说明TNF-α与IL-6参与脾炎症反应。免疫组化统计结果说明在感染过程中TNF-α蛋白上调表达，第5d达到最高，这与荧光定量结果相符。　　结论:DRV感染雏鸭脾脏结构和功能均受到影响，脾脏PKR炎症信号通路被激活且激活状态与脾损伤的程度相关。炎症细胞因子TNF-α、IL-6在感染后显著升高，提示PKR炎症信号通路以及TNF-α、IL-6的表达参与DRV致脾损伤。