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1,烟雾萃取剂促血管平滑肌增殖的研究吸烟导致动脉粥样硬化的一个病理特点是血管平滑肌细胞的过度增殖,因此,我们设计了本课题来研究吸烟诱发血管平滑肌细胞过度增殖中的分子途径。以磷酸盐缓冲液为溶剂制备烟雾萃取剂,在体外实验中模拟吸烟的过程。在分别加入烟雾萃取剂后检测增殖活力曲线,结果初步说明烟雾萃取剂可以抑制血管内皮细胞增殖并促进平滑肌细胞增殖。在加入能特异性抑制p-ERK表达的U0126后,U0126可以抑制烟雾萃取剂诱导的平滑肌细胞增殖,初步确认了ERK途径为此信号通路的初始端。采用Western Blot检测增殖相关通路上蛋白的表达,烟雾萃取剂可以促进细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的磷酸化活化形式p-ERK、转录因子c-Jun的磷酸化活化形式p-c-Jun和细胞周期蛋白cyclinDl的表达增加。结合之前的研究结果,初步推测烟雾萃取剂诱导的血管平滑肌细胞增殖中涉及到的分子途径如下：p-ERK—p-c-Jun或者p-ERK—cyclinDl。为了确认p-c-Jun和cyclinDl在此通路中的关系,分别采用过表达c-Jun的质粒及抑制c-Jun表达的siRNA转染细胞,结果表明c-Jun和cyclinDl的表达正相关,确认了如下途径：p-c-Jun—cyclinDl。综上所述,我们确认了烟雾萃取剂诱导血管平滑肌过度增殖的分子途径为：p-ERK—p-c-Jun—cyclinDl。血管组织所处的局部环境对血管疾病的发生发展起到不可忽视的作用。血管外周脂肪组织对于血管生理状态具有重要影响。我们采用0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μmol/L地塞米松和10mg/L胰岛素成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1细胞的成脂改变,为后续开展脂肪细胞微环境在吸烟中作用的研究提供了基础。2,氧化处理下的巨噬细胞对于血管内皮细胞和平滑肌细胞的影响无论在动脉粥样硬化的病理进程中,还是在血管手术损伤中,氧化应激贯穿始终。我们选用H202为探讨在氧化应激条件下巨噬细胞分泌因子的改变,以及其对血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖的影响。通过预实验我们以0.25mmol/L和0.5mmol/L为工作浓度,对细胞进行氧化应激处理并制备巨噬细胞的条件培养基。CCK-8测定生长曲线结果显示氧化应激对细胞生长有较明显的抑制作用。在内皮细胞中,对照组的生长曲线最高；而在平滑肌细胞中,巨噬细胞条件培养基组的生长曲线最高。说明巨噬细胞对于内皮细胞和平滑肌细胞有不同的影响。上述不同结果是巨噬细胞分泌细胞因子所产生的作用。ELISA检测巨噬细胞分泌的白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)随时间和H202的浓度增加而增高,肿瘤坏死因子-α (TNF-α)则无明显变化。内皮细胞分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)只有在H2O2到达1.0mmol/L浓度时才有明显增高。进一步研究氧化应激和巨噬细胞条件培养基对于增殖的影响,Western Blot检测结果显示在血管平滑肌细胞中增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白cyclinDl表达均降低,而在内皮细胞中只有PCNA表达降低,cyclinDl的表达无明显变化。此外,内皮细胞分泌的内源性一氧化氮合酶(eNOS)在过氧化处理组表达增加,综合说明了内皮细胞对于氧化损伤有一定的抵抗作用。最终研究结果表明,氧化应激处理可影响巨噬细胞炎性因子的分泌,进而影响血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和生理状态。