【摘 要】
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苹果是多年生果树,在遗传上高度杂合,采用传统的杂交育种方法培育一个优良品种难度大且周期长。现代生物技术,尤其是转基因技术的快速发展为苹果的良种选育提供了新的途径,但是目前苹果的遗传转化主要以叶片器官发生为再生体系,其转化效率较低,限制了该技术在实际育种工作中的应用。通过体细胞胚胎发生获得再生植株的方法具有数量多,速度快,成苗率高,遗传稳定性好等优点,并且以直接体细胞胚胎发生为基础的遗传转化可以减少
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苹果是多年生果树,在遗传上高度杂合,采用传统的杂交育种方法培育一个优良品种难度大且周期长。现代生物技术,尤其是转基因技术的快速发展为苹果的良种选育提供了新的途径,但是目前苹果的遗传转化主要以叶片器官发生为再生体系,其转化效率较低,限制了该技术在实际育种工作中的应用。通过体细胞胚胎发生获得再生植株的方法具有数量多,速度快,成苗率高,遗传稳定性好等优点,并且以直接体细胞胚胎发生为基础的遗传转化可以减少转基因嵌合体的发生率。因此我们建立了苹果叶片直接体细胞胚胎发生体系,并以该体系为基础进行遗传转化。现有研究结果如下:1.体细胞胚胎发生体系的建立:我们以‘嘎啦’苹果组培苗为材料,通过对外植体材料的选择、培养基激素的调整、培养条件的优化等过程,建立最佳的苹果直接体细胞胚胎发生体系为:选择继代培养30天的组培苗顶部第2-4位的展开叶,切取叶片靠近叶柄部位的叶块为外植体,先在MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 6 mg/L+2,4-D 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L的胚性细胞诱导培养基中黑暗培养8天,再转入MS+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L的胚胎发生培养基黑暗培养25天。经光照壮苗30天后,叶片体细胞胚胎发生率为82.3%,单叶平均再生体细胞胚数量为9.1个。2.遗传转化体系的建立:以叶片直接体细胞胚胎发生体系为基础,通过调整预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间、筛选压力,以GUS瞬时转化效率为指标建立了有效的遗传转化体系为:叶片先在胚性细胞诱导培养基中预培养6天,侵染时农杆菌菌液浓度为OD600=0.4、侵染时间10 min,共培养2天然后在胚胎发生培养基中进行脱菌、筛选。3.转基因植株的获得:为直观的展示基于体细胞胚胎发生的苹果遗传转化体系的可行性,我们构建了CRISPR/Cas9载体对苹果PDS基因进行基因突变,成功获得转基因白化植株。
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