论文部分内容阅读
CDPK（Calmodulin-depended protein kinase），即钙调素依赖的蛋白激酶，作为一种重要的Ca2+信号受体广泛参与植物体的各种生理生化过程。CDPKs包含四个保守性差异很大的功能区，从N端起依次为可变区、催化区、连接区及调控区。研究表明，CDPK可以作为植物受病原物侵染后触发一系列抗病反应的一项重要必要条件。因此，开展CDPK的研究对揭示植物抵抗病原菌侵染的机制具有重要意义。本实验室前期通过抑制性差减杂交试验结果发现，部分TaCDPK基因在小麦受叶锈菌侵染后表达量发生变化，预示着TaCDPK家族可能在小麦与叶锈菌互作过程中起作用。随后以TaCPK2为研究对象进行的RT-PCR及western试验初步证实，TaCPK2可能参与小麦抗叶锈菌侵染的信号转导过程；并通过酵母双杂交筛选得到TaCPK2的互作蛋白序列，其中一个序列与sHSP（Small heat shock protein）具有高度同源性。为进一步研究TaCDPKs在小麦与叶锈菌互作过程中的作用，本试验以小麦中的14个TaCDPK基因为研究对象，根据14个小麦TaCDPK基因序列分别设计特异引物，将小麦品种洛夫林10分别与叶锈菌生理小种260和165组成不亲和组合与亲和组合，在接菌后0h、4h、8h、12h、16h、24h、48h分别取样，利用实时定量PCR技术检测14个TaCDPK基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达谱。结果发现，14个TaCDPK基因的表达模式可分为四类：TaCPK1、TaCPK2、TaCPK6、TaCPK7在不同组合中在叶锈菌侵染早期表达量均明显升高，初步推测这4个基因可能在叶锈菌侵染小麦诱发的基础抗性表达过程中起正调控用；TaCPK3、TaCPK18、TaCPK19三个基因在不同组合中在叶锈菌侵染早期表达量均明显下降，初步推测这3个基因可能在叶锈菌侵染小麦诱发的基础抗性表达过程中起负调控作用；而TaCPK5、TaCPK8、TaCPK9、TaCPK12、TaCPK13、TaCPK15六个基因的表达量在不同组合中随接种时间的延长变化不明显；另外TaCPK4在两种组合中前期表达量并无明显差异，且表达趋势相近，但是在接种后48h不亲和组合表达量明显升高，而亲和组合的表达量基本没有变化，初步推断TaCPK4在小麦抗叶锈菌侵染的后期可能参与了由抗病基因介导的防卫反应诱发过程。在此基础上，本试验用TaCPK2激酶区构建诱饵载体，与酵母双杂交文库Mating互作，筛选与TaCPK2相互作用的蛋白，得到了3个阳性克隆。经测序分析，其中一个阳性克隆为Zea mays clone155847940S ribosomal protein S5mRNA,complete cds，另一个阳性克隆是hypothetical protein TRIVR307388[Triticum urartu]，第三个测得序列的阳性克隆是sHSP（Small heat shock protein）。鉴于上述结果，利用酵母一对一共转化将TaCPK2和sHSP共转化到酵母细胞中验证两者间的相互作用，初步证实两者间发生了相互作用。以上结果为进一步研究sHSP在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的作用及Ca2+信号通路奠定了基础；亦为深入探讨TaCDPK家族在小麦与叶锈菌互作过程中的作用机制奠定了试验基础。