目的:当前糖尿病肾病(Diabetic nephropahty,DN)已成为导致终末期肾病维持性透析的主要病因,给家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神压力。糖尿病肾病主要病理特征是肾小球系膜细胞肥大、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)堆积进而发生肾小球硬化。megsin是近年来研究发现的一种在肾小球系膜细胞优势表达基因,其表达产物属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),因此而命名(mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin)。已有研究表明在IgA肾病中megsin表达增强,与系膜细胞和基质增生密切相关,而糖尿病状态下megsin表达如何,在糖尿病肾病的发生、发展过程中起何作用,目前尚缺乏相关报道。肾小球细胞外基质的主要成分为IV型胶原、层粘连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)。正常时,这些成分不断更新,处于严格控制的动态平衡中。参与肾脏细胞外基质代谢的酶类主要为丝氨酸蛋白酶系统(纤溶酶原激活物-纤溶酶系统)和基质金属蛋白酶系统,细胞外基质合成或降解出现异常及其成分的数量或组成发生改变,都将影响肾脏固有细胞的功能,导致肾脏疾病的发生、发展。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases ,MMPs)是调控肾脏ECM代谢的一个重要的降解系统,包括明胶酶、间质胶原酶、基质溶素、弹力蛋白酶以及分泌型和膜型MMP等,它们的活性均依赖锌离子,活化的基质金属蛋白酶可以协同地降解多种ECM成分,其中MMP-2、MMP-9是起关键作用的酶。先前的实验研究表明,在megsin转基因小鼠的抗肾小球基底膜肾炎模型中,病理显示有持续细胞外基质扩增,高度提示megsin作为功能性的丝氨酸蛋白酶抑制剂在基质代谢调控中发挥了重要作用。纤溶酶是megsin的生物学底物之一,也是MMPs常见的激活剂,可以直接降解细胞外基质成分,megsin可以与纤溶酶结合,直接抑制其降解LN、FN及明胶的作用,并且可以间接阻断纤溶酶对基质金属蛋白酶系统的激活作用,从而抑制MMP-2、MMP-9等的活性,致使其降解明胶及IV型胶原的作用受阻,但是尚需要深入的研究证实。本课题拟通过链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导建立糖尿病CD-1小鼠模型,并采用尾静脉注射方法导入megsin质粒、空质粒和megsin siRNA质粒,观察megsin基因过表达和抑制状态下糖尿病小鼠肾脏组织中基质金属蛋白酶(MMP-2)、组织型基质金属白酶抑制剂(TIMP-2)、IV型胶原表达水平的变化,探讨megsin基因在糖尿病小鼠肾脏肾小球细胞外基质代谢过程中的作用机制,为人类糖尿病肾病的早期防治提供实验性理论依据。方法:清洁级健康雄性12周龄CD-1小鼠,共60只,行单侧肾切除,随机抽取45只腹腔注射STZ((溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,浓度2%,pH值4.5,注射剂量150mg/kg)方法制备糖尿病小鼠模型, 48小时后测定血糖、尿糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖持续阳性确定为糖尿病小鼠模型,随机将检测成模的45只糖尿病小鼠分为糖尿病+空质粒导入组(B组)、糖尿病+megsin质粒组(C组)和糖尿病+siRNAmegsin质粒组(D组),各15只,将只做单侧肾切除15只小鼠作为正常对照组(A组),采用尾静脉注射导入质粒载体,每周注射1次,整个实验期间小鼠自由饮食,不使用胰岛素及其它降糖药物。于实验开始后12周末收集血、尿及肾组织标本,检测血肌酐、24h尿蛋白定量及肾重/体重比值;石蜡切片行HE和免疫组化染色,肾组织蛋白用Western-bloting法检测,观察肾小球固有细胞数目变化及megsin、IV-型胶原、MMP-2、TIMP-2表达情况,结果用均数±标准差(x±s)表示,组间差异性比较采用单因素方差分析和q检验,显著性水平等于0.05,应用SAS9.2软件包对所有数据进行统计学处理。结果:1各组小鼠24小时尿蛋白定量、血肌酐及肾重/体重比值的比较糖尿病小鼠成模4～5天后即出现多饮、多食、多尿表现,而A组则无上述情况出现。12周末B组小鼠尿蛋白定量、血肌酐和肾重/体重比值升高(P<0.05),C组升高更为明显(P<0.01),D组尿蛋白和肾重/体重比值较C组降低(P<0.05)。2病理组织学改变HE染色可见A组小鼠肾小球结构基本正常,1周和2周末B组肾小球固有细胞数目较A组明显增多(P<0.05),C组增多更显著(P<0.01),伴有系膜基质增多;12周末B组肾小球固有细胞数目较A组略有增多,但差异无显著性,C组较B组细胞数目减少(P<0.05),伴有肾小球肥大;D组肾小球固有细胞数目少于同期C组差异有显著性(P<0.05)。3免疫组织化学结果1周和2周末B组小鼠肾组织中megsin、IV型胶原和TIMP-2表达与A组相比均增强,MMP-2表达减弱,12周末差别更为显著(P<0.05);C组与B组相比,肾组织中megsin、IV型胶原和TIMP-2水平进一步升高,MMP-2水平进一步降低,12周末变化趋势更显著(P<0.01);D组小鼠肾组织中megsin、IV型胶原和TIMP-2表达弱于同期B组和C组(P<0.05),MMP-2水平较同期B组和C组增强(P<0.05)。4 Western Blot结果从第1周开始,B组小鼠megsin、IV型胶原和TIMP-2蛋白水平开始升高,MMP-2水平降低,12周末变化更显著,较A组有显著差异(P<0.05);C组与B组相比变化趋势更显著(P<0.01);D组megsin、IV型胶原和TIMP-2表达弱于同期B组和C组(P<0.05),MMP-2水平较同期B组和C组增强(P<0.05)。结论:1 megsin在糖尿病肾病时表达增强,与肾脏细胞外基质积聚、肾脏肥大及肾功能受损程度相一致,提示megsin在糖尿病肾病的发生发展中起一定作用。2 megsin过表达状态下糖尿病小鼠肾组织中MMP-2表达进一步降低,TIMP-2表达进一步增强,IV型胶原水平明显升高,提示megsin可能与TIMP-2发挥协同效应,共同抑制MMP-2降解细胞外基质的作用,促进了糖尿病肾病的病变进展。3通过megsin siRNA质粒转染证实,megsin低表达时糖尿病小鼠肾组织中MMP-2/TIMP-2失衡状态得到缓解,肾小球细胞外基质积聚及肾功能受损减轻,提示抑制megsin的表达是早期防治糖尿病肾病的有效途径,为筛选防治糖尿病肾病的新靶点提供了科学依据。