目的　　 肝脏缺血.再灌注损伤(ischemia reperfusion injure,IRI)是肝外伤、肝移植以及机体遭受重度创伤、烧伤、休克等临床常见的病理生理现象,也是许多肝缺血性疾病预后不良的重要原因。肝缺血再灌注可引发肝组织细胞出现坏死、凋亡等不可逆损害,甚至导致肝功能衰竭。因此,深入研究肝脏缺血.再灌注损伤的病理生理机制及寻找各种抗肝缺血.再灌注损伤策略一直是肝脏研究领域的重要方向。作为一种启动机体内源性保护机制的方法,缺血预处理(ischemic preconditioning,IpreC)对肝脏缺血一再灌注的保护作用已得到普遍的认可。然而,由于IpreC必须在器官长久缺血前实施,这在一定程度上限制了其在临床的推广。最近,一种新的干预策略-缺血后处理(ischemic postconditioning,IpostC)因其能减轻心脏缺血-再灌注损伤而引起了广泛的关注。IpostC是指通过在再灌注起始时,实施数个循环的短暂的血流灌注(on)/阻断(off),能够减轻随后再灌注引起的损伤。IpostC实施方法与IpreC相似,但其具有简便易行、实施时机合理等优点,因而在临床应用方面具有诱人的应用前景。但是,目前大多数IpostC研究多集中在心脏方面,对其他脏器缺血.再灌注损伤是否具有保护作用尚不确定,因此本研究首先探讨了不同方式的IpostC对小鼠肝脏缺血.再灌注损伤是否具有保护作用,并与IpreC和联合应用IpreC与IpostC的抗损伤效果进行了比较,为今后的应用提供实验依据。此外,还对IpostC抗肝脏缺血再灌注损伤的机制进行了探讨。　　 缺血再灌注损伤是多因素参与的复杂过程,目前认为,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的爆发生成以及由此引发的过氧化损伤是肝脏缺血-再灌注损伤的重要原因;同时,肝脏Kupffer细胞和肝窦内皮等多种细胞激活并释放炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)等也在肝脏缺血-再灌注损伤的发生发展中起重要作用。因此,我们探讨了抗氧化系统及致炎性细胞因子-TNF-α、IL-1在IpostC抗肝缺血.再灌注损伤中的作用。　　 在肝脏缺血.再灌注过程中,细胞在遭受缺血、缺氧损伤刺激的作用下必然同时启动自身的防御性机制,缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)作为缺氧感受器,是细胞在缺氧条件下产生的重要的核转录因子,由α和β亚基组成。缺氧时HIF-1可作为基因调节蛋白与靶基因结合,促进靶基因转录,目前已知有100多种靶基因的表达受其调节,可引起细胞对缺氧的一系列适应性反应,如:促进红细胞生成,调节血管功能,以及促进糖酵解方面有重要作用。组织细胞中缺氧诱导因子的稳定性和活性受到脯氨酸羟化酶(prolinehydroxylases,PItDs)的严密调控,PHDs是催化降解HIF-1的限速酶。缺血再灌注损伤的前提是缺血缺氧,缺氧可启动HIF-1/PHD系统,但再灌注后细胞内已激活的HIF-1/PHD系统如何变化,以及该系统在再灌注损伤时的作用等,迄今尚未见报告。为此,本研究进一步观察了IpostC对再灌注早期小鼠肝组织中HIF-1/PHD系统,及其靶基因——血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响,为进一步阐明缺血再灌注损伤及IpostC的保护作用机制提供新思路,为IpostC未来的研究和临床应用提供坚实的理论基础。　　 方法　　 一、动物模型复制　　 (一)缺血预处理(IpreC)动物模型复制:　　 1、肝脏缺血预处理组(IpreC-H):分离并暴露门静脉,应用3个循环的缺血5min/再灌注5min后,结扎门静脉。缺血30min,再灌注1h。　　 2、双下肢缺血预处理组(IpreC-L):双下肢轮扎,应用3个循环的缺血10min/再灌注10min后,分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注1h。　　 3、对照组(Control):分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注1h。　　 (二)缺血后处理(IpostC)动物模型复制:　　 1、IpostC-1:分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注起始采用3个循环10s灌注/10s阻断(10son/10soff)后,灌注1h。　　 2、IpostC-2:分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注起始采用3个循环30s灌注/30s阻断(30son/30soff)后,灌注1h。　　 3、IpostC-3:分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注起始采用3个循环1min灌注/1min阻断(1minon/1minoff)后,灌注1h。　　 (三)缺血预处理联合缺血后处理动物模型复制:　　 1、肝脏缺血预处理联合缺血后处理组(IpreC-H/IpostC-2):分离并结扎门静脉,应用3个循环的缺血5min/再灌注5min后,缺血30min,再灌注起始采用3个循环30s灌注/30s阻断(30son/30soff)后,灌注1h。　　 2、双下肢缺血预处理联合缺血后处理组(IpreC-L/IpostC-2):双下肢轮扎,应用3个循环的缺血10min/再灌注10min后,分离并结扎门静脉,缺血30min,再灌注起始采用3个循环30s灌注/30s阻断(30son/30soff)后,灌注1h。　　 二、各项指标检测　　 (一)采用全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性:采集各组小鼠颈静脉血0.5ml,常温下1200rpm离心2min,取血清,用全自动生化分析仪测定各组血清AST、ALT水平。　　 (二)采用分光光度比色法测定小鼠肝组织中总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,评价抗氧化机制在IpostC抗肝缺血-再灌注损伤中的作用:再灌注1h后处死小鼠,冰上取肝组织,用生理盐水制成10%肝组织匀浆,低温离心,取上清液,按试剂盒说明书分别测定总抗氧化能力和MDA的含量及SOD、CAT、NOS、GSH-PX活性。BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组的蛋白含量。　　 (三)采用双抗体央心ABC-ELISA法检测小鼠血清中。TNF-α和IL-1的浓度:采集各组小鼠颈静脉血0.5ml,常温下1200rpm离心2min,取血清,分别按照小鼠TNF-α、IL-1ELISA检测试剂盒说明,在波长492nm处检测小鼠血清中TNF-α和IL-1的含量。　　 (四)采用RT-PCR法测定肝组织中TNF-α和IL-1 mRNA的表达情况:再灌注1h后处死小鼠,冰上取肝组织,参照RNAout说明书分别提取各组肝组织总RNA。逆转录反应总体积及逆转录反应条件,参见TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0,PCR过程:根据Gene Bank报告的序列设计TNF-α和IL-1 mRNA的引物,序列如下:　　 TNF-α:sense5-CCACCATCAAGGACTCAA-3Antisense5-GTCACCAAATCAGCGTTA-3,456bp;　　 IL-1:sense5-GAGATTGAGCTGTCTGCT-3Antisense5-GGAGAACCAAGCAACGAC-3313bp;　　 (五)采用RT-PCR法和Western Blot法分别测定各组肝组织中HIF-1、PHD、VEGF mRNA和蛋白表达情况:再灌注1h后处死小鼠,冰上取肝组织,参照RNAout说明书分别提取各组肝组织总RNA。逆转录反应总体积及逆转录反应条件,参见TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver3.0,PCR过程:根据Gene Bank报告的序列设计HIF-1α、PHD、VEGF mRNA的引物,序列如下:　　 HIF-1α:sense5-GGTATTATTCAGCACGACT-3Antisense5-ACTTGGGTAGAAGATGGAG-3,445bp;　　 PHD:sense5-CTCAGCAGTATGGTGTCCGT-3Antisense5-ATACACTCTTGGGCAGGAAC-3525bp;　　 VEGF:sense5-GTCGGGTGGGAGTTATGG-3Antisense5-GACGAGGTTTGAGGAAGG-3,154bp;　　 Western Blot法所需兔抗鼠HIF-1、PHD、VEGF的一抗,购自abcam公司,按1:500稀释:再灌注1h后处死小鼠,冰上取肝组织,加RIPA裂解液充分裂解,BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组的蛋白含量,调蛋白浓度行SDS-PAGE凝胶电泳,用PVDF膜行转膜:90V,90min。脱脂奶粉封闭,洗膜,一抗4℃孵育过夜,沈膜,二抗孵育2h,ECL化学发光设备处成像。　　 三、应用SPSS11.5软件进行统计学处理。　　 实验所得数据用均数±标准差(x±SD)表示,组间比较采用方差分析,P＜0.05为差异有显著性。　　 结果　　 一、缺血后处理对缺血-再灌注损伤肝脏的保护作用研究　　 (一)不同方式的缺血后处理对缺血-再灌注肝脏的保护作用:与对照组相比,IpostC-2和IpostC-3组在再灌注1h后谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性明显降低(P＜0.05),IpostC-2组降低更明显,差异非常显著(P＜0.01);IpostC-1组ALT和AST活性无降低。结果提示IpostC-2组具有显著的抗肝缺血-再灌注损伤、保护肝功能的作用。　　 (二)与对照组相比,IpreC-H、IpreC-L、IpostC-2、IpreC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2组ALT、AST活性均明显降低,差异显著(P＜0.05)。与IpreC和IpostC相比,IpreC/IpostC联合应用组ALT和AST值进一步降低,差异显著(P＜0.01)。结果提示联合应用IpreC和IpostC能提供相加的抗肝缺血再灌注损伤作用。　　 二、缺血后处理抗氧化机制的研究　　 与对照组相比,IpostC-2和IpostC-3组在再灌注1h时肝组织中总抗氧化能力增强,MDA检测过氧化脂质生成减少,而SOD、NOS、CAT和GSH-PX活性增高(P＜0.05),以IpostC2组各项指标变化更明显:IpostC1组各项指标无明显改善。与单独应用IpreC和IpostC相比,联合应用IpreC和IpostC能进一步改善缺血再灌注肝组织中抗氧化酶系统SOD、GSH-PX、NOS和CAT的活性,提高肝组织总抗氧化能力,减少脂质过氧化物的生成。结果提示IpostC具有抗氧化损伤作用,联合应用IpreC和IpostC能提供相加的抗氧化损伤效果。　　 三、缺血后处理对炎性细胞因子表达的影响　　 与对照组相比,IpreC组、IpostC2组、IpreC-H/IpostC-2组和IpreC-L/IpostC-2组小鼠血清中TNF-α和IL-1的浓度明显降低(P＜0.05),肝组织中TNF-α和IL-1mRNA的表达显著降低(P＜0.05);与单独应用IPreC和IPostC相比,联合应用IPreC-IPostC对TNF-α和IL-1表达的影响不显著。结果提示IpreC、IpostC2、IpreC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2可抑制kupffer细胞炎性细胞因子的表达,但联合应用IpreC和IpostC未能产生相加的抑制效果。　　 四、缺血后处理对HIF-1/PHD系统及其调节蛋白的影响　　 与对照组相比,IpreC组、IpostC2组、IpreC-H/IpostC-2组和IpreC-L/IpostC-2组小鼠肝组织中HIF-1和VEGF mRNA的表达显著增加(P＜0.05),其Western-Blot结果在蛋白水平证实肝脏HIF-1和VEGF的含量与对照组相比明显增加(P＜0.05);与对照组相比,IpreC、IpostC组、IpreC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2组小鼠肝组织中PHD mRNA的表达减少(P＜0.05),Western-Blot检测结果显示,PHD的蛋白含量与对照组相比明显降低(P＜0.05)。与单独应用IpreC和IpostC相比,联合应用IpreC-IpostC可显著增加小鼠肝组织中HIF-1和VEGF mRNA的表达(P＜0.05)和对应的蛋白浓度,同时可抑制PHD的表达。结果提示,IpostC抗肝脏缺血-再灌注损伤的机制与细胞的缺氧应答反应密切相关,可通过刺激该应答反应中重要的转录因子-HIF-1的表达并保护其结构的稳定,发挥其调节下游靶基因转录与合成功能,促进细胞适应缺氧,提高组织抵抗缺血-再灌注损伤的能力。联合应用IpreC和IpostC能产生相加的保护效果。　　 结论　　 1、缺血后处理能够保护肝功能,具有抗小鼠肝缺血-再灌注损伤作用。再灌注起始采用3个循环30s灌注/30s阻断(30son/30soff)的方案抗小鼠肝缺血-再灌注损伤的效果最好。　　 2、联合应用缺血预处理和缺血后处理可以提供相加的保护作用,其中远端肢体缺血预处理与缺血后处理的联合应用尚属首次,该方案操作简便易行,对机体损伤小,可明显提高缺血后处理对缺血-再灌注肝脏的保护效应。　　 3、缺血后处理抗小鼠缺血.再灌注肝损伤作用与抗氧化作用机制有关,缺血后处理可增强缺血-再灌注肝组织总抗氧化能力,减少脂质过氧化物的生成,通过提高抗氧化物质SOD、GSH-PX、NOS和CAT的活性减轻脂质过氧化反应,发挥抗肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用。联合应用IpreC-IpostC可产生相加的抗氧化效果。　　 4、缺血后处理能够抑制小鼠缺血-再灌注肝组织中炎性细胞因子的合成与分泌,减轻缺血-再灌注肝脏的炎性损伤。IpreC-IpostC的联合应用未能产生相加的抑制效果,可能与缺血-再灌注损伤发生的时相以及IpreC、IpostC各自发挥保护作用的机制相关。　　 5、缺血后处理能够促进肝细胞发生缺氧应答反应,其作用机制可能与促进缺氧诱导因子-1及其调节靶基因VEGF的表达有关。联合应用IpreC-IpostC可产生协同作用。　　 6、本研究不仅能为缺血后处理的临床应用提供理论和实践依据,而且为丌发新的模拟缺血后处理作用机制药物提供参考,还可为防治缺血-再灌注肝损伤提供新的作用靶点,具有广阔的应用前景以及重要的应用价值和意义。