碱提米渣分离蛋白过程中赖丙氨酸的生成及超声波技术控制研究

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米渣是一类开发价值较高的蛋白质资源。工业上主要采用碱溶酸沉法制备纯度较高的米渣分离蛋白,但稀碱溶液提取蛋白时容易产生赖丙氨酸(LAL)。LAL的生成不仅能降低了蛋白质的营养价值,食用后还可能对机体产生不利影响。目前对植物蛋白中LAL的生成规律、消化吸收特性以及控制方法等方面研究较少。本文旨在研究碱提条件对米渣分离蛋白中LAL生成的影响规律,探讨LAL的生成过程;研究LAL的生成对米渣分离蛋白功能特性、结构特性和消化吸收特性的影响;探寻利用超声波控制米渣分离蛋白LAL生成的技术,并研究其影响规律和作用机制。主要研究结论如下:(1)研究了米渣分离蛋白碱提过程中LAL的生成规律。通过研究不同碱处理条件对LAL含量和氨基酸组成变化的影响探究了LAL的生成规律。结果表明,随着NaOH浓度从0.03 mol/L上升到0.09 mol/L,LAL含量由256 mg/kg上升到13 079 mg/kg,而当NaOH浓度继续提高至0.13 mol/L时,LAL含量下降到1 540 mg/kg。碱处理温度和处理时间与LAL含量呈正相关。氨基酸分析结果表明,碱处理能显著地降低了米渣分离蛋白中胱氨酸、苏氨酸和赖氨酸含量,其中胱氨酸降低幅度最大。碱处理米渣分离蛋白LAL生成的交联反应可能是:胱氨酸或少量半胱氨酸残基残基通过β-消除反应生成脱氢丙氨酸残基,脱氢丙氨酸残基的共轭碳碳双键与赖氨酸的ε-NH2生成LAL。(2)研究了碱处理过程中LAL的生成对米渣分离蛋白的功能特性和结构特性的影响规律。随着碱(NaOH)浓度、碱处理温度和处理时间的增加,米渣分离蛋白的溶解度、乳化性及乳化稳定性、起泡性均先升高后降低,起泡稳定性没有显著地变化。碱处理通过降低α-螺旋、β-转角含量和增加β-折叠、无规则卷曲含量来改变米渣分离蛋白的二级结构,微观结构结果表明米渣分离蛋白的表面形貌和表面粗糙度也随碱处理条件的变化而变化,蛋白表面出现了更多的微小颗粒、小碎片,结构变得更加疏松。蛋白微孔数量显著增加,表面粗糙度Rq和Ra也随之增加。(3)研究了碱提条件对米渣分离蛋白体外消化和LAL肠吸收特性的影响,借助体外模拟消化、大鼠在体小肠灌流模型等试验手段开展研究。随着碱(NaOH)浓度和碱处理温度的增加,米渣分离蛋白的体外消化率均先上升后下降;随着碱处理时间的延长,米渣分离蛋白的体外消化率下降。经胃胰蛋白酶消化后,米渣分离蛋白消化产物中的精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和一定程度上的苏氨酸迅速地释放,碱处理不同程度地减少了氨基酸的释放并破坏了一部分赖氨酸。LAL不能很好地被胃胰蛋白酶消化,仅仅释放了LAL总含量的2.65-9.28%。经胃胰蛋白酶消化后,酶解液中蛋白结合态LAL分子量主要集中在1000-3 000 Da,主要是以结合态形式存在于较长的肽链。较高的碱液浓度提取能显著地降低了米渣分离蛋白的吸收率,LAL在大鼠小肠内没有特定的吸收部位,且在小肠各肠段吸收情况均不高,其在空肠端的吸收速率参数Ka最大值为6.27×10-6 min-1,在回肠段的吸收速率参数Ka最大值为4.03×10-7 min-1。(4)研究了碱提米渣分离蛋白过程中利用超声波控制LAL生成的技术。利用聚能式双频超声设备和五频逆流S型超声波设备处理,以控制米渣蛋白LAL的生成,分别筛选了超声最佳工作模式和工作参数。聚能式双频超声和五频逆流S型超声均能显著降低碱提米渣分离蛋白中LAL含量,且提高了蛋白溶出率。其中五频逆流S型超声设备的作用效果更好,特别是在20/40 kHz双频组合时,米渣分离蛋白中LAL含量为11 057 mg/kg蛋白,与未经超声处理的样品相比降低了24.37%,此时,蛋白溶出率为71.47%。在五频逆流S型超声20/40 kHz双频模式下,得出最佳的超声参数为:超声功率密度36 W/L、超声温度38℃、超声时间22min。验证试验表明在最佳条件下,米渣分离蛋白中LAL含量为11 093 mg/kg蛋白。(5)研究了超声波处理条件对碱提米渣分离蛋白结构的影响规律。总巯基和游离巯基、化学间作用力结果表明,超声处理能改变蛋白分子间的化学作用力,离子键相对含量和疏水互相作用力增加,氢键含量和二硫键含量下降,其二硫键含量减少促使交联生成更多的巯基,游离巯基含量增幅与LAL的生成直接相关。超声处理促使米渣分离蛋白的二级结构由有序结构(α-螺旋、β-转角)向无序结构(β-折叠、无规则卷曲)转变,其中超声功率密度对蛋白二级结构的影响较大。超声功率密度对蛋白二级结构的影响较大。超声处理后蛋白粒径分布曲线向粒径较小的方向移动,蛋白粒径减小,蛋白小颗粒数量增加,蛋白颗粒分布比较集中和均匀。Zeta电位绝对值降低,说明蛋白溶液中带负电荷的氨基酸残基减少,不利于LAL的生成。(6)通过皮尔逊相关性分析、主成分分析、逐步多元回归分析等方法,研究了超声处理米渣分离蛋白碱提过程中结构特性的变化与LAL的定量关联模型。皮尔逊相关性分析结果表明,米渣分离蛋白中LAL含量与游离巯基含量、Zeta电位值、总巯基含量极显著负相关(P<0.01),与α-螺旋具有极显著正相关(P<0.01)。主成分分析结果表明,三个主成分积累方差贡献率为89.705%,这三个新变量能反映蛋白原始变量的变化信息。其中第一主成分是无规则卷曲、α-螺旋、β-折叠和总巯基,第二主成分是粒径和游离巯基,第三主成分是Zeta电位值。经过逐步多元回归分析,得到在超声处理过程中米渣分离蛋白的游离巯基含量和Zeta电位值是影响米渣分离蛋白中LAL生成的最重要因素。
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