林木谷氨酸脱羧酶(GAD)基因克隆及其催化产物GABA的调控功能

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盐胁迫是一类重要的非生物胁迫因子,影响植物的生长和发育,甚至导致严重的生态环境问题。盐胁迫会引起植物各种生理变化和适应性反应,这些生理反应过程都需要通过植物细胞感知和传递信号分子,引起细胞内与胁迫相关基因的表达,最终参与调节和抵御盐胁迫对植物造成的伤害。在生理适应反应过程中,已经发现活性氧和植物激素参与胁迫信号调控和响应。谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物体内广泛存在的一种酶,在盐胁迫下能迅速响应和发挥生理作用。GAD由GAD基因编码,能催化谷氨酸脱羧生成重要的四碳非蛋白质氨基酸小分子——γ-氨基丁酸(GABA),对调解细胞pH值、氮贮存、发育和碳的代谢以及抗逆分子信号调控等方面具有重要作用。过去对于GAD基因家族逆境下表达模式已经有了一定的研究,但是对于盐胁迫下GAD基因和GABA在分子水平与活性氧、激素等的信号物质共同参与抗逆信号调控机制需要进一步研究。本研究主要采用RACE技术首次克隆得到中间锦鸡儿(Caragana liouana)2个GAD基因,并通过NaCl胁迫处理和外源施加ABA处理中间锦鸡儿幼苗,并对其GAD基因进行表达模式分析和GABA含量测定。除此之外,对模式植物毛白杨(Populus tomentosa Carr.)在盐胁迫下分别施加高浓度和低浓度的GABA后进行生理指标测定和构建数字基因表达谱,并结合生物信息学分析和定量验证确定转录水平下与活性氧、激素合成和信号传导相关的差异基因的表达变化,主要研究结果如下:1.根据已知的ClGADs基因转录组测序序列信息,采用RACE技术获得完整的2个ClGAD基因的cDNA全长序列,并命名为ClGAD1和ClGAD1。碱基序列分析表明,ClGAD1和ClGAD2编码的蛋白均含有吡哆醛脱羧酶保守结构域。氨基酸序列比对发现C末端包含高度保守的赖氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)结合位点,对于GAD结合CaM催化生成GABA发挥重要的作用。氨基酸序列系统进化树结果反映出ClGAD1与ClGAD2存在于不同的进化位置。2.通过NaCl胁迫处理和外源施加脱落酸ABA实验,对中间锦鸡儿ClGAD1和ClGAD2进行表达模式分析,发现随着盐胁迫时间的延长,根和叶中Cl GAD1和ClGAD2表达模式截然相反,但ClGAD2的相对表达量远高于ClGAD1。表明这两个GAD基因成员对盐胁迫的敏感程度不一样。外源施加ABA实验表明,低浓度ABA在短时间内会显著提高内源GABA含量,并且ClGAD1在叶片中表达量显著低于ClGAD2,ClGAD2基因在叶片中的表达更加敏感。表明中间锦鸡儿GAD基因家族成员在抗盐生理和调控机制各自行驶功能有所不同3.通过NaCl胁迫下外源施加GABA对毛白杨幼苗进行生理指标测定和构建基因表达谱。结果显示0.25 mM GABA在6 h内迅速提高胞质GABA含量,抑制ROS生成和清除相关基因的表达,并且对IAA、ABA和ETH合成及其信号传导基因有产生较大的影响,说明外源低浓度GABA确实能够在盐胁迫下一定程度的调控ROS和激素代谢相关基因的表达,这与胞质pH值变化、Ca2+信号途径、转录因子的信号传递密切相关。高浓度GABA应该是作为一种氮源在一定程度上缓解胁迫产生的生理伤害,并进一步探讨其作用的原理和机制。
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