核桃蛋白水解物的抗氧化性及其二肽基肽酶Ⅳ抑制活性研究

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脱脂核桃粕是核桃油加工的副产品,蛋白质含量高达50%以上,并含有多酚和膳食纤维等营养成分,具有较高的利用价值。目前,国内核桃粕产品的经济附加值较低。论文以脱脂核桃粕为原料,在考察核桃蛋白质组成的基础上对核桃蛋白的酶水解特性进行了研究;进一步对核桃肽的制备工艺进行了优化;随后对核桃蛋白水解物的抗氧化活性,尤其是多酚和核桃肽对抗氧化活性的相对贡献等方面进行了考察;最后对核桃肽的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制活性进行了探究,旨在为核桃生物活性肽的制备提供方法和理论依据。主要研究内容和结果如下:首先,针对核桃蛋白分子组成不明确的问题,采用还原SDS-PAGE和质谱鉴定,发现核桃蛋白主要由7S球蛋白和11S球蛋白组成;通过对角线电泳和双向电泳发现,核桃11S球蛋白亚基(56000~58000)是由相对分子质量为32000~35000(pI 5.5~7.5)和19000~22000(pI 9.0~10.0)的肽链通过二硫键连接组成。在此基础上,分别考察了五种蛋白酶对核桃蛋白的水解特性。碱性蛋白酶对核桃蛋白的水解效率最高,酶解1 h时核桃7S球蛋白和11S球蛋白A肽链均已被水解,而11S球蛋白B肽链(22000)具有较强的抗水解能力。碱性蛋白酶酶解5 h,其水解度达到21.70%,TCA可溶性氮含量为84.23%,此时水解物得率为81.58%,相对分子质量小于2000的肽段占72.69%,因此可采用碱性蛋白酶来制备核桃肽。随后,确定了直接以核桃粕为原料制备核桃肽的工艺,具体包括酸洗、高速剪切、碱性蛋白酶酶解、膜分离脱盐和喷雾干燥工序,核桃肽产品得率(基于核桃粕蛋白)为76.74%,蛋白质含量(干基)为85.12%,相对分子质量小于2000的肽占81.6%。其次,对核桃蛋白水解物体外抗氧化活性进行了探究。核桃蛋白碱性蛋白酶水解物具有较高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羟基自由基清除率的IC50值分别为0.109 mg/mL、39.890μg/mL和1.174 mg/mL,在1.0 mg/mL的蛋白浓度下,水解物还原力(A700)达到1.2。而且,核桃蛋白水解物可以保护谷胱甘肽巯基免受芬顿试剂诱导的氧化,并能再生氧化谷胱甘肽中1/3的巯基。同时,考察了多酚和核桃肽对水解物抗氧化活性的相对贡献,研究发现,在核桃蛋白水解物中,多肽起主要的抗氧化作用,大约80%的自由基清除活性由多肽提供,而核桃多酚的存在可以提高水解物10%~25%的自由基清除活性及50%的铁还原能力。最后,进一步研究了核桃蛋白水解物的DPP-Ⅳ抑制活性。核桃蛋白经蛋白酶水解后,具有DPP-Ⅳ抑制活性,碱性蛋白酶水解物的DPP-Ⅳ抑制活性最强,其IC50为0.90mg/mL。水解物通过超滤分离和阳离子交换层析富集,其DPP-Ⅳ抑制活性比未分离的水解物高约3倍(76.19%,0.25 mg/mL)。富集得到的肽组分富含碱性氨基酸(34.35%),尤其是精氨酸含量高达25.93%。所得到的核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽在高温(121°C)、极端pH(pH 1.0和pH 11.0)和胃肠道消化条件下,均显示出良好的稳定性。
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