慢性病毒性肝炎特别是乙型和丙型肝炎的治疗是当今世界面临的一个难题。我国是病毒性肝炎的高发区，HBsAg携带者占我国总人口的8-10％，同时由于乙肝可以通过母婴垂直传播，影响下一代，故危害极大。因病毒性肝炎发展隐匿，且目前尚缺乏有效的治疗手段，造成大量的慢性肝病患者长期迁延不愈，其中部分病人经过5-20年会发展为肝纤维化，部分患者最终出现肝硬化或者肝癌，严重威胁病人的生命。肝脏有解毒和清除毒物的功能，同时也是毒物经常攻击的器官，在解剖上接受肝动脉和门静脉双重血液供应。化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学物中的毒性物质损害。肝细胞损伤是各种肝病共同的病理基础，其长期存在往往是导致肝纤维化，甚至是肝硬化、肝癌的重要始动因素。因此治疗肝细胞损伤是临床肝病治疗的主要环节之一。已知多种致病因素可导致肝细胞损伤，如肝炎病毒、酒精和药物中毒等。肝损伤是一种由多因素介导的复杂的生物学过程，损伤的结果是肝细胞可能发生凋亡或坏死。通过建立实验性肝损伤模型，研究肝脏发病机制，筛选保肝药物，探索保肝作用机理，具有重要的临床意义。 热休克蛋白(HSPs)是进化中高度保守的蛋白家族，其成员在细胞中有组成性和诱导性两种表达方式。HSPs能帮助维持细胞稳态，提高细胞在恶劣环境下的生存能力，是细胞防御机制的重要组成部分。体内外研究发现许多应激因子都能引起HSPs瞬时高表达来保护由应激引起的损伤。HSPs的细胞保护作用主要是由于能与损伤的蛋白质结合，帮助其重新折叠成天然构象。当细胞受到化学性或物理性刺激导致蛋白质变性，HSPs能够阻止变性蛋白质疏水区的聚集而提高变性蛋白质的溶解性。双环醇(4，4'-Dimethoxy-5，6，5'，6'-bis(methylene-dioxy)-2-hydroxymethy1-2'-methoxycarbonyl bipheny1)是我所自主研发的抗肝炎新药，作为一种新型的抗肝炎药物于2004年批准用于临床治疗慢性病毒性肝炎。本实验室对双环醇的肝脏保护作用进行了大量而充分的研究。先后采用五种不同的实验性肝损伤动物模型研究研究了双环醇的保肝作用，结果表明双环醇对CCl4、D-氨基半乳糖(D-GaIN)、扑热息痛(APAP)、卡介苗加脂多糖和刀豆蛋白A(ConA)引起的小鼠肝损伤均有保护作用。其作用机制包括清除自由基、抑制肝细胞凋亡、保护线粒体、促进肝脏解毒等。临床应用双环醇能降低慢性乙肝病人血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平，并兼有一定的抗乙型肝炎病毒的作用，乙型肝炎病毒转阴率为20％。但是双环醇的肝脏保护机制还未完全阐明。内源性HSPs可帮助维持细胞稳态，提高细胞恶劣环境下的生存能力，有细胞保护作用。基于以上理论，我们设想双环醇的肝脏保护作用是否通过诱导HSPs而实现的。为了证实这个设想，我们将从以下三部分进行研究： 1.双环醇对小鼠肝脏HSP27/70的诱导作用及对扑热息痛诱导小鼠肝损伤的保护作用本实验旨在研究抗肝炎新药双环醇对小鼠肝脏HSPs表达的影响及其在肝损伤中的保护作用。昆明种小鼠在24 h内连续灌胃双环醇200 mg/kg三次，末次给药后不同时间点取肝脏测定HSPs，发现双环醇可时间依赖性的提高HSP27和HSP70的表达。另外，双环醇100，200和300 mg/kg在24h内灌胃小鼠三次，同时给予槲皮素200 mg/kg，末次给药后6 h取肝脏检测HSP27和HSP70的表达，结果显示，双环醇剂量依赖性的在蛋白和mRNA水平提高HSP27和HSP70的表达，而槲皮素能抑制双环醇对HSP27/70的诱导作用。Western blot检测发现双环醇能提高热休克因子-1(HSFI)的磷酸化和入核。凝胶迁移阻滞实验结果表明双环醇能提高HSF1与热休克元件(HSE)的结合活性。在APAP造成的小鼠肝损伤模型中研究了双环醇诱导HSPs与其保肝作用的关系。小鼠在24 h内灌胃双环醇300 mg/kg三次，同时给予槲皮素200 mg/kg，末次给药后4 h腹腔注射APAP 200 mg/kg，6 h后取肝脏和血清做各项指标的测定。发现双环醇诱导的HSP27和HSP70对APAP引起的小鼠血清ALT/AST的升高、肝细胞凋亡和坏死以及线粒体的损伤均有保护作用。以上结果表明双环醇能诱导小鼠肝脏HSP27和HSP70高表达，该作用是通过激活HSF1实现的，双环醇的肝脏保护作用与其诱导HSPs高表达有关。本结果为解释双环醇抗肝损伤作用提供了新的理论依据。 2.双环醇对ConA诱导小鼠肝损伤的保护作用与其诱导HSP27/70的关系本实验主要研究双环醇诱导的HSPs能否减轻由ConA引起的肝损伤及相关机制。结果显示，双环醇可时间(200mg/kg)和剂量(100，200，300mg/kg)依赖性的诱导注射ConA小鼠肝脏HSP27和HSP70的表达，双环醇对HSP27和HSP70的诱导作用是通过激活HSF1实现的。双环醇(300mg/kg)可以减轻由ConA引起的小鼠肝损伤，表现为降低小鼠血清转氨酶ALT/AST的水平，改善肝细胞凋亡和坏死以及线粒体损伤导致的cytochrome c和凋亡诱导因子(AIF)的外漏。双环醇的肝脏保护作用与HSP27和HSP70高表达一致，HSPs合成抑制剂槲皮素能减弱双环醇的作用。双环醇诱导的HSP27和HSP70可抑制ConA引起的NF-κB通路的激活，表现为HSP70与IκB相互作用抑制IκB的降解，HSP27与IKK相互作用抑制IKK的激活，进而抑制NF-κB p65的核转位以及与核内DNA的结合活性。HSP27和HSP70还可抑制由ConA引起的JNK和p38的活化。以上结果表明，双环醇可通过诱导小鼠肝脏HSP2/70而实现抗ConA所致肝损伤的作用，其保肝作用主要是通过HSP27/70抑制NF-κB和MAPK通路实现的。 3．RNAi技术研究环醇诱导的热休克蛋白抗D-氨基半乳糖引起的HepG2细胞凋亡的作用机制上述研究证明双环醇具有HSPs诱导作用，并且与其保肝作用密切相关。本实验采用RNAi技术进一步阐明双环醇诱导HSP27/70的作用与其抗肝细胞凋亡的关系。实验用D-GaIN诱导HepG2细胞凋亡及相关转导信号的变化观察双环醇的作用。结果显示双环醇(50μM)能时间依赖性的诱导HSP27/70的表达。双环醇(25，50和100μM)剂量依赖性的在蛋白和mRNA水平诱导HSP2/70的表达和激活HSF1。MTT结果显示D-GaIN时间和剂量依赖性的降低HepG2细胞的存活率。应用流式细胞仪PI染色也显示细胞出现了典型的G-1亚峰，Hoechst33258染色显示细胞核固缩浓染，或呈碎块状、颗粒状致密浓染，即出现了比较典型的凋亡细胞特征。采用RNAi抑制HSP70表达，发现双环醇诱导的HSP70在D-GaIN诱导HepG2细胞凋亡具有保护作用。此外，双环醇诱导的HSP27和HSP70可抑制D-GaIN引起的HepG2细胞caspase-3的活化，NF-κB p65核转位及DNA结合活性，IKK的磷酸化以及IκB的降解。HSP70可以抑制JNK的磷酸化，而HSP27对JNK的磷酸化抑制作用不明显。免疫共沉淀结果显示，HSP27与cytochrome c相互作用，HSP70与Apafl和AIF相互作用，从而抑制D-GaIN引起的HepG2细胞凋亡。以上结果表明双环醇对肝细胞损伤具有保护作用，主要是通过诱导HSP27和HSP70实现的。HSP27和HSP70主要通过抑制NF-κB和JNK凋亡信号转导通路，与凋亡通路中重要的蛋白质如cytochrome c、Apaf1和AIF结合，抑制caspase-3的活化，在肝细胞凋亡中发挥重要的保护作用。 结论：1.双环醇可激活HSPs合成的重要转录因子HSF1，启动热休克基因的转录，诱导小鼠肝脏HSP27和HSP70的高表达。2.双环醇诱导的HSP27和HSP70在保护APAP和ConA诱导的小鼠肝损伤以及D-GaIN引起的HepG2细胞凋亡中发挥着重要作用。3.双环醇诱导的HP27和HSP70主要通过抑制NF-κB和JNK凋亡信号转导通路，与凋亡通路中重要的蛋白质如cytochrome c、Apafl和AIF结合，抑制caspase-3的活化而实现其抗肝损伤的作用。