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Bacillus subtilis源的碱性聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)已在苎麻纤维脱胶方面得到了广泛的应用,为了构建一株更适合苎麻纤维工业化脱胶用的工程菌,本论文首先对Bacillus ubtilis 7-3-3进行了基因改造。pelC基因是Bacillus subtilis 7-3-3基因组中的一个碱性果胶裂解酶基因,通过构建穿梭表达质粒pNW33N-pelC,增加pelC基因在Bacillus subtilis 7-3-3中的拷贝数,实现了pelC基因在Bacillus subtilis7-3-3中的同源过表达,提高了发酵液的PGL酶活。在摇瓶发酵96 h后,同源过表达菌株B-pN-pelC的PGL酶活由Bacillus subtilis 7-3-3的102 U/mL提高到了 169 U/mL,约提高了 60%。通过对粗酶液的酶组分进行分析,发现与出发菌株相比,菌株B-pN-pelC粗酶液中的木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活也分别提高了约20%和10%,分别达到1.555 U/mL和0.525-U/mL,而CMCase和FPA酶活则无明显差异。本实验室前期研究表明,Bacillussubtilis7-3-3的另一碱性果胶酶组分PelA是粗酶液中的一主要蛋白,浓度很高,推测pelA的启动子的强度和信号肽的介导效率比较有优势。为进一步提高pelC的表达分泌,所以用pelA的启动子和信号肽序列来介导pelC的表达分泌。将pelA基因的启动子和信号肽序列(PSpelA)和终止子(TpelA)插入到克隆质粒pNW33N,成功构建含有信号肽的Ecoli-Bacillus穿梭表达质粒pNW33N-pst,然后再插入无信号肽的pelC结构基因,成功构建pNW33N-pA-pelC-pst质粒,实现了pel 基因的启动子和信号肽介导的pelC基因在Bacillus subtilis 7-3-3中的同源过表达,结果表明:明显提高了pelC的表达分泌量,使转化子B-pN-pA-pelC-pst粗酶液中的蛋白浓度由菌B-pN-pelC 的 0.3682 mg/mL 提高到了 0.5204 mg/mL,蛋白质浓度约提高了 40%,但其粗酶液中的PGL酶活为145.29 U/mL,仅是B-pN-pelC的粗酶液的PGL酶活的86.42%。此外,对B-pN-pA-pelC-pst粗酶液酶组分分析,其木聚糖酶、甘露聚糖酶、CMCase和FPA酶活分别与B-pN-pelC粗酶液中的无明显差异。本实验室前期工作表明,碱性果胶酶PelA和PelC在苎麻脱胶方面有一定的协同作用,尝试构建了 pelA和pelC共表达的穿梭表达质粒pNW33N-pelA-pelC,在B.subtilis 7-3-3菌株中同时实现了pelA和pelC基因的同源过表达,B-pN-pelA-pelC粗酶液中PGL酶活得以大幅度提高,PGL酶活达到了 1458 U/mL,相比较B-pN-pelA菌株粗酶液的PGL酶活提高了 20%,首次实现了具有相互协同作用的PelA和PelC共同同源过表达。使用各基因工程菌的粗酶液对苎麻纤维进行酶法脱胶,发现:pelC过表达量越多,粗酶液的脱胶效果越好,综合分析得出,pelA和pelC共表达菌株B-pN-pelA-pelC的粗酶液是苎麻纤维脱胶用的最佳选择。经过pelC过表达菌株粗酶液处理后,苎麻纤维的白度和分散性都有不同程度的提高,分析各基因工程菌的粗酶液中的酶组分发现:pelC基因的过表达还能够提高粗酶液中木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活,从而有利于苎麻胶质中半纤维素的降解和脱除,提高脱胶率,使得脱胶后的苎麻纤维的分散性和白度也得到了不同程度的改善。