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背景T1D是一种由自身免疫系统引起的慢性代谢性疾病。T1D主要的发病机理是免疫系统应答反应过强导致胰岛β细胞的损坏。在破坏胰岛β细过程中,T细胞特别是CD4+T细胞亚型中Th1与Tregs细胞发挥着重要的作用。MSCs能够对T细胞进行免疫调节,主要通过分泌可溶性因子与细胞间的直接接触对T细胞进行免疫抑制。PD-L1作为膜蛋白在诱导T细胞无反应性和维持机体外周免疫耐受中发挥关键的作用,研究显示PD-L1/PD-1通路在MSCs对免疫细胞进行免疫抑制过程中起重要的作用。那么MSCs通过何种方式对T1D的CD4+T细胞进行免疫调节,以及相关的分子机制仍需研究。本实验首先通过流式细胞术探究正常与T1D脾细胞CD4+T细胞及其亚型Th1和Tregs细胞比例的区别;其次探究BMSCs与T1D脾细胞共培养后对脾细胞CD4+T细胞及其亚型Tregs和Th1细胞比例的影响,以及在共培养后BMSCs的PD-L1和脾细胞的PD-1表达的变化;最后在BMSCs与T1D脾细胞共培养体系中加入PD-L1阻断抗体来探究PD-L1/PD-1通路在BMSCs对T1D脾细胞Tregs和Th1细胞比例调节中的作用。目的将BMSCs与T1D脾细胞进行共培养来探究BMSCs对T1D的CD4+T细胞免疫调节的作用及机制。方法1.取雄性C57BL/6J小鼠,通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建T1D小鼠模型,测量小鼠的空腹血糖以及体重。提取正常和T1D小鼠的胰腺组织,通过对小鼠胰腺进行苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)染色,观察正常与T1D小鼠的胰腺组织结构的区别。采用组织研磨法提取正常和T1D小鼠的脾细胞,对脾细胞进行CD4-PE标记通过流式细胞术检测正常与T1D脾细胞中CD4+T细胞及其亚型Tregs和Th1细胞比例的区别。2.采用全骨髓贴壁培养法提取正常小鼠的BMSCs,将BMSCs与T1D脾细胞进行共培养来探究BMSCs对脾细胞的免疫调节作用。由于BMSCs可以通过分泌可溶性的因子(间接接触)以及与T细胞进行直接接触来对T细胞进行免疫调节。因此通过将BMSCs与T1D脾细胞在Transwell小室下共培养,来探究BMSCs与T1D脾细胞在间接共培养条件下对脾细胞的免疫调节作用;将BMSCs与T1D脾细胞共培养,来探究BMSCs与T1D脾细胞在直接接触下对脾细胞的免疫调节作用。具体的分组为a.脾细胞(正常),b.脾细胞(T1D),c.脾细胞(T1D)+BMSCs,d.脾细胞(T1D)+BMSCs(Transwell小室)。对脾细胞进行CD4-PE标记,流式细胞术检测与BMSCs共培养后T1D脾细胞CD4+T细胞比例的变化情况;分别对脾细胞进行IFN-γ-APC、CD4-PE以及CD4-FITC、CD25-PE-Cy7、Foxp3-PE标记,检测与BMSCs共培养后T1D脾细胞中Th1与Tregs细胞比例的变化情况。提取共培养体系中BMSCs和脾细胞中的RNA和蛋白,通过RT-q PCR和Western-Blot检测BMSCs与T1D脾细胞共培养后BMSCs的PD-L1和脾细胞的PD-1在m RNA和蛋白水平上表达的变化。3.在BMSCs与T1D脾细胞共培养体系中加入PD-L1阻断抗体,通过流式细胞术检测Th1与Tregs细胞比例的变化情况。结果1.与正常小鼠相比,T1D小鼠的胰岛组织受到破坏;T1D脾细胞CD4+T细胞含量增多其亚型Th1细胞比例升高(P<0.001),Tregs细胞比例降低(P<0.001)。2.当T1D脾细胞与BMSCs直接共培养后,Th1细胞的比例减少(P<0.001),Tregs细胞的比例升高(P<0.01);但是在Transwell小室的情况下,Th1与Tregs细胞的比例并没有发生变化(P>0.05)。同时T1D脾细胞与BMSCs共培养体系中BMSCs的PD-L1和脾细胞的PD-1在RNA和蛋白水平上的表达均升高(P<0.001)。3.当在BMSCs与T1D脾细胞的直接共培养体系中加入PD-L1阻断抗体阻断PD-L1/PD-1通路后,共培养体系中Th1、Tregs细胞的比例与T1D脾细胞相比没有变化(P>0.05)。结论1.与正常脾细胞相比,T1D脾细胞的CD4+T、Th1细胞比例高,Tregs细胞比例低。2.BMSCs通过与T1D脾细胞直接接触,下调Th1细胞比例,上调Tregs细胞比例。3.PD-L1/PD-1通路在BMSCs下调T1D脾细胞Th1细胞,上调Tregs细胞起重要作用。