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白蜡虫(EriceruspelaChavanness)对极端高温和低温具有非同寻常的耐受能力,这对白蜡虫种群分布和白蜡生产具有重要意义。为研究热激蛋白(heatshockprotein,Hsp)与白蜡虫适应极端温度以及白蜡虫发育的相关性,本研究采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,在本实验室白蜡虫转录组中7个不同的hsps(hsp21.5,hsp21.7,hsp40,hsp60,hsp70,hsc70,hsp90)基因序列的基础上,选择白蜡虫雌成虫和二龄雄虫2个有代表性的虫态,分析高温和低温胁迫下hsps的基因表达变化,以及雌雄白蜡虫不同虫态hsps的基因表达动态;并选择对温度胁迫和在不同虫态中变化较为显著的hsp20家族成员(hsp21.5和hsp21.7)和hsp70家族成员(hsp70和hsc70),进行了全长基因克隆。研究获得以下主要结果:
(1)hsp21.7、hsp60、hsp70和hsp90对白蜡虫高、低温胁迫敏感
高温:①雌成虫。在白蜡虫雌成虫中,7个hsps均能被高温不同程度地诱导,其中hsp21.7和hsp70基因表达显著上调,hsp90基因的表达量也有显著增加。②二龄雄虫。在白蜡虫二龄雄虫中,hsp90和hsp21.7的mRNA的上调显著,而hsp21.5和hsc70的mRNA却是下调表达的。
低温:雌成虫。在白蜡虫雌成虫中,除hsp40外,其它6个hsps均能被低温不同程度地诱导,其中,hsp21.5和hsp70对低温诱导更为敏感。
(2)hsp21.5、hsp40、hsp60、hsp70和hsc70与雌雄白蜡虫的发育调节相关
①在白蜡虫雌虫中,除了hsp21.7和hsp90外,其它5个hsps在雌虫的发育中均有上调表达。hsp21.5的mRNA表达水平在二龄幼虫期达到最大;hsp40、hsp60和hsp70在成虫期有明显上调表达;hsc70在一龄幼虫期有显著的上调表达。②在白蜡虫雄虫中,所检测的7个hsps均有上调表达,其中hsp21.5的mRNA表达量在成虫期显著上调;而其它6个hsps的mRNA水平均是在二龄幼虫期为最高。
(3)白蜡虫hsp20的序列特征
ep-hsp21.5和ep-hsp21.7的cDNA全长分别为997和873bp,开放阅读框(openingreadingframes,ORFs)为570和564bp,推测编码189和187个氨基酸,蛋白质的分子量分别为21.5和21.7kDa,均含有保守的α-晶体结构域,这表明它们都是小分子Hsp(sHsp)。在系统发育分析中,ep-Hsp21.5和ep-Hsp21.7分别聚为两支,ep-Hsp21.5与同源性(orthologous)sHsp聚在一起;而ep-Hsp21.7和物种特异性(species-specific)sHsp聚在一起。
(4)白蜡虫hsp70的序列特征
ep-hsp70和ep-hsc70的cDNA的全长分别为2355和2417bp,ORFs分别为1908和1962bp,推测编码635和653个氨基酸,相对分子量分别为69.8和71.6kDa,均含有Hsp70家族的三个特征序列。在系统发育分析中,ep-Hsp70与诱导型Hsp70聚为一支,ep-Hsc70与组成型Hsc70聚为一支,且两者均与细胞质Hsp70聚在一起。hsc70基因组DNA序列有4个内含子,分别为1139、255、514和94bp。第一个内含子最长,位于5UTR;其余3个内含子均位于编码区内。
在白蜡虫中,诱导型hsps,如ep-hsp21.7和ep-hsp70,参与温度胁迫;ep-hsp21.5和ep-hsc70是组成型hsps,参与白蜡虫的发育调节,这与大部分研究结果类似。而在极端温度下,组成型hsp也会参与白蜡虫的温度耐受。