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背景与目的噬血细胞综合征(hemophagocytic syndrome,HPS),也称噬血细胞淋巴组织细胞增生症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH),是一种复杂且罕见的高炎症反应性综合征。HLH的发病迅速,病情危重,预后差,急性发作时自然杀伤(NK)细胞的数量往往显著减少,活性降低,其发病机制与NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的穿孔素依赖的细胞毒作用缺陷导致T淋巴细胞和巨噬细胞的过度增殖和活化、细胞因子大量释放(俗称细胞因子风暴)有关,因此,NK细胞作为HLH疾病发生发展过程中的重要机制细胞,已然已经成为研究该疾病相关机制的重要载体细胞。同时,NK细胞是CD3~-CD56~+CD16~+为特征的细胞群,是先天性免疫细胞,可以识别和杀伤不受主要组织相容性复合体(MHC)限制或未致敏的异常细胞,被认为是体内监测和清除病变细胞最有效的免疫细胞亚群。因此,目前NK细胞作为免疫治疗的关键性细胞已成为研究热点,备受关注。然而NK细胞仅占正常人外周血单个核细胞(PBMC)的5%-10%,其体外扩增培养难度较大。目前的研究表明,白介素(IL)-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21等细胞因子在体外扩增NK细胞方面发挥一定的作用。IL-21属于IL-2家族,是一种常见的γ链细胞因子,由活化的CD4~+T细胞表达,在NK细胞激活、成熟和增殖中起着重要作用。在人体内,IL-21对NK细胞有刺激增殖作用,通过增加穿孔蛋白和颗粒酶B的表达,刺激NK细胞的细胞毒活性。已有研究证明,IL-21联合IL-2和IL-15共同作用,可对NK细胞增殖、细胞毒活性和IFN-γ的产生均具有正向效应。鉴于NK细胞作为肿瘤免疫具有巨大应用潜力的免疫细胞,加之其在HLH发病机制中扮演重要的角色,对其体外扩增,增强其抗肿瘤活性及深入研究HLH发病机制等均是当前研究的课题。已有多种培养体系被用于体外扩增,大多采用间隙性添加NK生长因子如IL-2、IL-15、IL-21及某些靶抗原如与K562细胞共孵育等,但均存在一定的问题。一些研究提示,NK细胞虽能扩增,但杀伤活性降低了;或虽能保持或增加杀伤活性,但扩增效率降低了。咎其原因,可能与培养体系不完善,间隙性添加NK生长因子为脉冲式提供NK细胞生长刺激,与生理状态明显不同有关。我们假设:如采用能持续分泌IL-21的细胞株作为饲养细胞,用于体外扩增NK细胞有可能解决其体外扩增效率并保持其杀伤活性的问题。本研究拟构建CHO-hIL21细胞株,探讨其持续分泌的IL-21为主的培养体系对NK细胞的体外扩增及杀伤功能的影响。本研究内容包括以下两部分进行:(1)CHO-hIL-21细胞株的建立及表达;(2)CHO-hIL21对NK细胞的影响。方法1. CHO-hIL21细胞株的建立及表达1.1 pLenti-IL-21慢病毒过表达载体的构建。查阅资料,检索Pubmed Genebank,查找IL-21基因序列,阅读框总长为489 bps,根据质粒构建要求,阅读框两端设计酶切位点Bam H I,连同酶切位点及阅读框序列,总长为501 bps,送公司进行全基因合成,以pLenti质粒载体合成返回。返回的质粒经过涂菌、挑克隆、摇菌、测序验证基因序列。1.2 转染CHO确定IL-21的表达。抽提pLenti-IL-21转染级质粒,脂质体法(Roche试剂)转染CHO细胞,24h后加入杀稻瘟菌素(Blasticidin)进行筛选并维持至最佳浓度,48h后收集培养基上清,利用流式细胞微球阵列检测(CytometricBead Array,CBA)技术检测IL-21的表达。1.3慢病毒包装。大量抽提穿梭质粒pLenti、pLenti-IL-21及包装质粒PSPAX2、Pmd2g,脂质体法(Lipofectamine 3000试剂)转染至293T细胞,收集上清,离心过滤,浓缩,有限稀释法测病毒滴度。1.4慢病毒感染CHO细胞。上述包装完整的慢病毒感染CHO细胞,同时加入Polybrene(终浓度为5μg/ml)增强感染效率,感染72h加入杀稻瘟菌素进行筛选。通过有限稀释法多次克隆化观察荧光强度和CBA技术检测IL-21浓度筛选出CHO-hIL21细胞株。1.5 IL-21的基因表达和蛋白表达鉴定。抽提CHO-hIL21细胞的RNA,并逆转录为c DNA,RT-PCR法检测CHO-hIL21细胞中是否有IL-21基因表达;一抗rabbitanti-IL-21 antibody,二抗goat anti-rabbit FITC,免疫荧光法检测CHO-hIL21细胞中是否表达IL-21蛋白。2.CHO-hIL21对NK细胞的影响。流式细胞术检测正常NK细胞对K562细胞的靶向杀伤能力。CCK-8实验检测Mitomycin C抑制CHO-hIL21细胞增殖的最佳浓度,Mitomycin C处理CHO-hIL21细胞,抑制细胞增殖,和NK细胞共培养,细胞计数仪计数NK细胞增殖能力,流式细胞术检测IL-21对NK细胞杀伤功能的影响,流式CBA技术定量检测NK细胞在IL-21介导下,Th1/Th2细胞因子水平的变化。结果1.CHO-hIL21细胞株的建立及表达1.1 pLenti-IL-21慢病毒过表达载体的构建。通过查阅相关资料和文献,确定IL-21基因序列,委托公司合成,测序结果进行基因序列比对,显示与设计序列完全一致,表明pLenti-IL-21慢病毒过表达载体构建成功。1.2转染CHO确定IL-21的表达。瞬时转染CHO细胞并定量检测IL-21浓度,结果显示,IL-21的分泌量可达800 pg/ml以上,提示质粒构建正确。1.3 慢病毒包装。成功包装了含IL-21目的基因的慢病毒过表达载体,收集病毒上清并浓缩50倍,滴度测定结果显示pLenti-IL-21滴度为4×10~8/ml,pLenti滴度为4.5×10~8/ml。1.4 慢病毒感染CHO细胞。慢病毒成功感染CHO细胞,多次克隆化筛选及流式CBA法定量检测结果显示,每次克隆化后IL-21浓度均呈倍数增加,最高可达3721.13pg/ml,从而确定稳定表达IL-21的CHO-hIL21细胞株。1.5 IL-21的基因表达和蛋白表达鉴定。RT-PCR法结果显示IL-21的条带大小(接近300 bps)与预期结果(298 bps)相符,提示筛选后的CHO-hIL21细胞中成功转入了pLenti-IL-21质粒;免疫荧光法结果显示,实验组在488nm激发光激发下的GREEN荧光场中有绿色荧光蛋白表达,空载组则无,提示筛选后的CHO-hIL21细胞中IL-21蛋白成功表达;Western-blot检测结果显示IL-21蛋白条带在15-20KDa之间,与IL-21分子量18KDa相符,同样表明筛选后的CHO-hIL21细胞中IL-21蛋白成功表达。2. CHO-hIL21对NK细胞的影响CCK-8实验结果显示,Mitomycin C对CHO细胞的最佳抑制浓度为10μg/ml,CHO-hIL21经Mitomycin C抑制后,检测细胞因子IL-21的分泌持续升高,提示Mitomycin C抑制CHO-hIL21扩增后短期内IL-21的分泌逐步升高,可达4842±444.3 pg/ml;CHO-hIL21和NK细胞共培养结果显示,PBMC中NK细胞无扩增,纯化的NK细胞扩增效率较低,且低于重组人IL-21+IL-2组(P<0.01)。和单独IL-2培养相比,培养至第9天,NK细胞存活率较高(P<0.05)。细胞因子水平结果显示,PBMC中的IL-6水平明显增高(P<0.001),纯化的NK细胞中仅IL-21+IL-2组IFN-γ水平轻微升高(P<0.05)。而在杀伤活性方面共培养前后无任何变化。结论1.成功构建人源IL-21的慢病毒过表达载体;2. 成功构建并筛选出高表达IL-21的CHO-hIL21细胞株;3. CHO-hIL21持续分泌可致PBMC中的NK细胞在培养过程中细胞因子IL-6水平显著增高;4. CHO-hIL21持续分泌对NK细胞的扩增能力较弱,但能提高NK细胞的存活率。