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视网膜的胶质细胞以放射状胶质细胞为主，又称Muller细胞。正常Muller细胞具有营养，支持，绝缘和保护作用。Muller细胞和视网膜神经元来源于同一种祖细胞。成年鸟类视网膜损伤后Muller细胞具有显著的神经再生能力，提示Muller细胞可能是成体视网膜内潜在的干细胞。最近研究结果显示体外聚集培养大鼠的Muller细胞能向神经元转化，表明在哺乳动物视网膜内，Muller细胞可能也具有神经再生潜力。然而对成年哺乳动物在体Muller细胞的神经再生潜能研究得较少。本课题通过建立感光细胞退化的大鼠模型，研究Muller细胞干细胞潜能的激活及损伤环境下向神经元特异性的分化；通过体外和在体实验探讨Sonic Hedgehog信号通路对Muller细胞干细胞潜能的调控及其作用机制，以期为将来视网膜退行性疾病特别是视网膜色素变性引起感光细胞损伤后的再生及视觉功能的修复提供新的思路。课题主要的研究方法和内容如下：(1)感光细胞退化动物模型的建立。①通过给予SD大鼠腹腔注射60mg／kg N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)来建立感光细胞特异性凋亡的动物模型。②采用HE染色，透射电镜和TUNEL染色方法检测视网膜外核层感光细胞的凋亡过程。③用免疫荧光染色方法观察各种视网膜神经元特异性抗体和突触蛋白的表达，检测MNU给药后对其他神经元形态和神经元间突触的影响。④用实时定量RT-PCR和免疫荧光染色法检测感光细胞缺失后视网膜节细胞melanopsin的表达变化及可能的生物节律改变。(2)Muller细胞干细胞潜能的激活。①Muller细胞激活的标志包括增殖，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和巢蛋白(nestin)的表达。应用免疫荧光双标染色法，即以抗Müller细胞特异标志物谷氨酰胺合成酶(GS)抗体与抗GFAP、nestin或核增殖抗原(PCNA)抗体的双标记，检测感光细胞损伤后Müller细胞是否激活。②Müller细胞增殖的机制。用免疫荧光染色和蛋白印迹(western-blot)检测Müller细胞激活前后细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin D3的表达变化。③Müller细胞是否向神经元的分化。用抗PCNA抗体分别与抗rhodopsin(视杆细胞标志物)、PKCa(双极细胞标志物)、syntaxin(无长突细胞标志物)和Thy1.1(节细胞标志物)抗体进行双标染色，检测增殖Müller细胞是否向视网膜神经元分化，并用抗突触蛋白抗体(synaptophysin)检测新生神经元周围突起的形成。④损伤环境下，移植的Müller细胞是否向神经元分化。经RT-PCR和流式细胞仪检测细胞纯度后，将体外培养的转Z／EG基因小鼠的Müller细胞，移植至模型鼠眼球玻璃体腔，应用抗LacZ抗体和抗视网膜神经元特异性标志物抗体的免疫荧光双标染色法，对所移植Müller细胞的生存，迁移和分化进行检测和分析，同时以视网膜祖细胞移植作为对照(3)Sonic Hedgehog(Shh)对体外Müller细胞特性的调控。①用原位杂交和RT-PCR检测感光细胞损伤后Shh的受体Patched(Ptc)．在视网膜的表达变化。②体外培养出生后一周内SD大鼠的Müller细胞，用RT-PCR检测Müller细胞是否表达Ptc和Shh下游转录因子Gli1。③用不同浓度SHH-N蛋白作用于Müller细胞，通过实时定量RT-PCR检测Ptc和Gli1 mRNA相应的变化。④采用细胞周期测定，Brdu／GS，PCNA／GS细胞荧光双标染色检测SHH-N对Müller细胞的增殖作用。⑤应用细胞荧光染色和western-blot检测Müller细胞在处理前后cyclinD1和cyclin D3的表达变化，揭示SHH-N促增殖的作用机制。⑥SHH-N是否诱导Müller细胞表达干细胞标志物。用RT-PCR和细胞荧光染色检测Müller细胞在SHH-N处理前后Pax6，nestin，Sox2，ABCG2和Musashi1的表达。⑦SHH-N是否诱导Müller细胞向感光细胞分化，用RT-PCR检测SHH-N处理后Müller细胞是否表达感光细胞的发育转录因子Nrl，Crx和rhodopsin。(4) Shh对在体Müller细胞的作用机制。动物模型建立6h内，右侧眼注射SHH-N蛋白溶液作为实验组，左侧眼注射生理盐水作为对照组。①检测Shh对感光细胞凋亡的作用。不同时间点取材后，用流式细胞仪和视网膜原位TUNEL染色法测定实验组和对照组外核层的凋亡指数。用western-blot检测实验组和对照组凋亡途径激活酶caspase-3和caspase-8的表达变化。②Shh是否促进在体Müller细胞增殖。通过GS／PCNA双标荧光染色统计实验组和对照组在各个时间点增殖Müller细胞的数量，并进行配对t检验分析。用western-blot分别检测实验组和对照组在各时间点Müller细胞cyclin D1和cyclin D3表达差异。③通过荧光双标PCNA／rhodopsin鉴定两组Müller细胞分化为视杆细胞的数量差异。主要结果如下：(1) 60 mg／kg MNU腹腔注射诱导视网膜外核层感光细胞快速发生凋亡，注射后1d凋亡达到高峰，7d时感光细胞完全消失。MNU并不诱导其他神经元包括双极细胞，无长突细胞，水平细胞和节细胞发生凋亡。感光细胞的缺失会引起节细胞上melanopsin表达下降，可能影响到动物的生物节律。(2)感光细胞的损伤诱导Müller细胞干细胞潜能的激活即表达GFAP和nestin，重新进入细胞周期发生增殖。Müller细胞在MNU注射后第2d增殖达到高峰，增殖主要通过上调细胞周期蛋白cyclin D1和cyclinD3而进行。MNU注射15d时，增殖的Müller细胞逐渐减少，部分增殖的Müller细胞开始表达成熟视杆细胞的标记物rhodopsin，28d和40d时，表达rhodopsin的细胞逐渐增多，同时突触蛋白synaptophysin表达在这些新生视杆细胞的周围。但并未检测到Müller细胞向其他神经元分化。取自Z／EG小鼠培养的Müller细胞共表达LacZ和GS，流式细胞仪检测细胞纯度达到97％，RT-PCR验证培养的Müller细胞没有受到其他神经元的污染。LacZ标记的Müller细胞移植入模型鼠玻璃体腔后从节细胞层逐渐迁移至内核层外侧，一部分细胞表达视杆细胞的标记物rhodopsin。作为对照培养的E18视网膜祖细胞能形成克隆，体外能被诱导分化为视网膜神经元和Müller细胞，玻璃体腔移植后也会发生迁移，但很难检测到神经元特异性标志物的表达。(3)原位杂交和RT-PCR结果显示感光细胞损伤后视网膜Müller细胞干细胞特性激活伴随着Ptc表达升高。Müller细胞表达Ptc和Gli1。加入5，10，20nM SHH-N后，Ptc和Gli1 mRNA的表达呈浓度依赖性上升。SHH-N促进体外Müller细胞的增殖，以20nM浓度时作用最明显。SHH-N通过上调周期蛋白cyclin D1和cyclin D3促进Müller细胞的增殖。SHH-N能诱导Müller细胞表达干细胞标志物Pax6，nestin，Sox2，ABCG2和Musashi1。SHH-N诱导Müller细胞表达视杆细胞发育转录因子Nrl和Crx，及成熟视杆细胞标记物rhodopsin。(4)玻璃体腔注射SHH-N后，实验组外核层细胞凋亡数明显少于未注射的对照组。实验组凋亡激活酶caspase-3和caspase-8的表达比对照组明显减少。SHH-N通过上调周期蛋白cyclin D1和cyclin D3促使在体Müller细胞发生增殖，在15，28，40d时增殖Müller细胞的数量比对照组明显增加。SHH-N诱导更多Müller细胞向视杆细胞分化。