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目的:构建携带人激肽释放酶(KK)基因的重组腺相关病毒载体,测定其感染滴度,并观察以不同滴度的病毒感染人脐静脉内皮细胞后KK基因的表达差异。探讨通过腺相关病毒载体导入KK基因治疗高血压的可行性。 方法:1、将人激肽释放酶(KK)基因定向克隆入腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS中构建成pAAV/KK。2、pAAV/KK和另外两种质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共转染AAV-293细胞,包装成带有目的基因的重组病毒。收集病毒颗粒,同时以pAAV-LacZ作为报告基因和pHelper、pAAV-RC三种质粒在和pAAV/KK完全相同的条件下共转染AAV-293细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定转染率,收集病毒原液。以不同稀释梯度的病毒感染HT-1080细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定病毒滴度。3、以不同滴度的病毒分别感染体外培养的脐静脉内皮细胞株(HUVEC)。培养72小时后,RT-PCR定量检测KK在该细胞中表达。 结果:1、成功构建了重组AAV人激肽释放酶载体,2、藉β-半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因LacZ在人纤维肉瘤细胞(HT1080)中的表达测得重组病毒滴度为6.2×10~7个/ml。3、采用RT-PCR法分别检测以1×10~6、1×10~5、1×10~4、1×10~3个/ml的病毒滴度感染HUVEC细胞株,与不加病毒组相比,1×10~6、1×10~5、1×10~4个/ml滴度组KK的表达均有增加(P<0.05),而以1×10~6个/ml组升高最明显(P<0.001)。1×10~3个/ml病毒组和不加病毒组相比,KK基因的表达无显著性差异(P>0.05)。 结论:带有KK的重组腺相关病毒滴度可以稳定地达到10~7个/ml以上,感染体外培养的人血管内皮细胞后,KK基因可以在宿主细胞中得到稳定的表达,和空白对照组相比差异显著。在实践上为高血压的基因治疗奠定了基础。