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植酸酶(Phytase)是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称。植酸酶添加在饲料中,会将其中的植酸水解成肌醇和磷酸,从而提高了磷的利用率,降低了粪便中磷的排放量,减少了植酸磷对环境的污染。更为重要的是,植酸酶可使植酸盐蛋白质复合物降解从而提高蛋白质的利用率,减少植酸盐对微量元素的螯合,提高饲料的营养价值。此外,植酸酶制剂在食品、医药等方面有广泛的应用。所以,植酸酶作为一种饲料添加剂,有着广阔的应用前景。植酸酶的研究现已成为世界性的研究热点之一。 尽管植酸酶的基因工程研究已有近十年的历史,但目前在饲料工业中还没有能够得到很好的推广利用,其最主要的原因是生产菌株的表达水平较低、植酸酶必须耐受工业生产中制粒过程的高温和动物消化道的低pH值。要想获得能满足符合生产要求的植酸酶,寻求优良基因源,通过基因工程手段,使多种有利特性集中到一株酶上,无疑是解决这一问题之有效途径之一。本研究所克隆的植酸酶基因不仅为植酸酶进一步在各种微生物、植物中表达提供了优良的基因源,而且弥补了食用菌中克隆植酸酶基因的空白。 采用透明圈筛选法从21株食用菌菌株中筛选出3株高产植酸酶菌株—金针菇1号、平菇1号和平菇2号。再根据GenBank中其他物种的植酸酶基因的保守区设计7条特异性引物,以金针菇1号、平菇1号和平菇2号菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,分别获得了长约789bp、919bp和622bp的目的片段。Blastx分析结果表明:Fla1目的基因区域与来源于Agrocybe pediades植酸酶基因(GenBank Accession:CAC48160)氨基酸序列同源性最高,为50%;Ple1目的基因区域和Ple2目的基因区域与来源于Trametes pubescens植酸酶基因(GenBankAccession:CAC48234)氨基酸序列同源性最高,分别为64%和47%。 再根据Ple2目的基因区域的序列设计嵌套引物,采用TAIL-PCR技术克隆平菇2号植酸酶基因区域两端的未知侧翼序列,经序列测定,得到长为1290bp的目的序列。经分析,该序列共编码387个氨基酸,在282～394bp处含有一个典型的真菌内含子序列:供体序列(donor)GTACGT和受体序列(accepter)CAG。G+C含量达54%,而密码子第三位碱基的G+C含量高达52.25%,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)有33个,负电荷氨基