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植物表达系统在基因工程研究领域越来越受到人们的关注和重视,叶绿体遗传转化系统因具有独特优势而成为目前植物生物反应器的研究热点。叶绿体转化系统可实现外源基因的定点整合和多基因的共同表达;叶绿体基因组拷贝数多,外源基因整合进入叶绿体基因组中,表达效率将得到明显提高;此外,叶绿体属于母系遗传,外源基因不会随花粉传播而发生逃逸现象,生物环境安全性较高。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)生长周期短、培养简便,体内含有一个约占细胞体积70%的大型杯状叶绿体,遗传操作简单易行,是进行重组蛋白表达的理想平台;烟草(Nicotiana tabacum)生物量大、组织培养和再生体系成熟,在高等植物叶绿体遗传转化研究中应用最为广泛。因此,本研究将猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2分别导入衣藻和烟草叶绿体中表达,为探索重要药用蛋白表达的新途径提供实验支持。本研究论文主要包括以下两部分内容:(1)猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2在衣藻叶绿体中的重组与表达本实验构建了含有人工优化合成的猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2和aadA抗性基因的衣藻叶绿体表达载体pCR02。通过基因枪转化法将表达载体pCR02导入衣藻叶绿体中,抗性筛选后共获得13个抗性衣藻转化子。PCR检测结果表明其中4个抗性衣藻转化子的PCR产物中扩增出现ORF2外源基因的目的条带,且ORF2外源基因准确整合到衣藻叶绿体基因组特定位点;RT-PCR、SDS-PAGE、Western-blot和ELISA分子生物学检测表明ORF2抗原基因在衣藻叶绿体内得到了有效转录和表达,并具有一定的免疫反应性。(2)猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2在烟草叶绿体中的重组与表达本实验根据烟草叶绿体基因组密码子的表达偏好性优化合成了猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2,选择来源于烟草叶绿体基因的融合启动子PrrnPclpPrbcL和终止子TpsbA为外源基因调控序列,烟草叶绿体基因16S-trnI-trnA-23S为同源重组序列,壮观霉素aadA为抗性基因,构建了含有ORF2抗原基因的烟草叶绿体表达载体pNK-a03。通过基因枪法将表达载体pNK-a03导入烟草叶绿体中,抗性筛选后得到20株抗性烟草植株。PCR检测结果表明有3株抗性植株的PCR产物中出现了 ORF2外源基因的目的条带;通过分别互补于烟草叶绿体同源重组序列和ORF2基因序列的引物对外源基因插入位点进行检测,结果表明ORF2外源基因准确整合进入烟草叶绿体基因组特定位点;通过RT-PCR、SDS-PAGE、Western-blot和ELISA技术检测,结果证实ORF2抗原基因在烟草叶绿体中实现了有效转录和表达,且重组蛋白具有一定的免疫反应性。