由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆疫病是一种严重威胁大豆生产的病害,每年给大豆生产带来严重损失。本文聚焦大豆疫病的生物防治,在对大豆疫霉拮抗细菌分离、鉴定、抑菌谱测定及发酵条件优化的基础上,研究了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BS-4菌株及其代谢产物对大豆疫病的生防作用及其机制。主要研究结果如下:1大豆疫霉拮抗菌的分离、鉴定及生理生化特性研究从安徽怀远大豆田块土壤中分离到1株对大豆疫霉具有强烈抑制作用的拮抗细菌BS-4。采用CTAB法提取BS-4菌株的总DNA,通过对其16S r DNA序列分析,进行了分子鉴定,并测定了其菌落形态及生理生化特性。同时还研究了温度、p H、培养时间和不同碳氮源对其生长的影响。结果显示,生防菌BS-4的16S r DNA序列片段大小为1416 bp,与Gen Bank数据库中已发表的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus strain Y58(序列号:EF203211.1)的同源性为89%;同时生理生化性质测定结果显示,BS-4与短小芽孢杆菌的生理生化特征极其相似,据此将BS-4鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus)。BS-4菌落初始呈圆形、淡黄色、半透明、表面光滑,培养后期其菌落颜色加深、透明度下降、表面凹凸不平出现褶皱、边缘不规则;BS-4菌株的生长受到温度、p H、培养时间和不同碳、氮源的影响,其适宜生长温度为20~45℃,最适生长温度为37℃;同时它能在p H为7~9的范围内快速生长,能够适应弱碱性的环境,其生长周期约为72 h。BS-4菌株能够利用多种碳源和氮源,以在含有麦芽糖和NH4Cl的培养基中生长最好。2生防菌BS-4抑菌谱的测定分别测定了生防菌BS-4菌株对15种病原真菌和8种疫霉菌的拮抗作用及其代谢液对不同病原菌的抑制作用。结果表明,BS-4菌株对不同病原菌的抑制作用具有差异性,其中BS-4菌株对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)具有强烈的抑制作用,抑制率均在70%以上;对稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、黄色镰孢(F.culmorum)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和串珠镰孢(F.moniliforme)具有中等抑制作用,抑制率在41.67~50.89%之间;对苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、雪腐镰孢(F.nivale)、尖孢镰孢(F.oxysporum)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)具有弱的拮抗作用,而对腐皮镰孢(F.solani)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)几乎没有拮抗作用;BS-4菌株除了对辣椒疫霉(P.capsic)的拮抗作用较弱外,对其他疫霉菌均在50%以上。BS-4菌株的代谢液对不同病原菌的抑制作用同样存在差异,其中对核盘菌、灰葡萄孢、禾谷丝核菌(R.cerealis)、小麦全蚀病菌和立枯丝核菌抑制率为100%,对串珠镰孢和黄色镰孢的抑制率与对峙试验相比显著下降;代谢液对疫霉菌具有明显的抑制作用。3生防菌BS-4发酵条件的优化分别测定了碳、氮源、无机盐对其发酵液生物活性的影响,采用正交试验法测定了其发酵培养基的最优配比;同时还测定了发酵温度、p H、接菌量、摇床转速和发酵时间等发酵条件对代谢液生物活性的影响。结果表明,生防菌BS-4能利用果糖、木糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖作为碳源,其中麦芽糖作为碳源产生的发酵液对大豆疫霉的抑制作用最好,抑制率达到了70.03%;试验还发现,BS-4在NH4Cl条件下产生的代谢液对大豆疫霉具有良好的抑制作用,另外还发现,KH2PO4能显著提高代谢液的抑菌活性。培养基配比正交试验表明,麦芽糖:NH4Cl:KH2PO4:胰蛋白胨比例为4:2:3:1时代谢液的抑制作用最明显,对大豆疫霉菌丝抑制率达到了71.42%,对不同配比的培养基进行比较发现,当C/N为4:3时产生的代谢液具有较高的抑制活性。发酵条件的优化结果表明:BS-4在p H为7-9之间的培养基,接菌量为2%,摇床转速为150 rpm,培养温度为30℃时,发酵4-5 d其产生的代谢液生物活性最高。4生防菌BS-4发酵液的理化性质及对大豆疫霉的抑制作用分别研究了生防菌BS-4发酵条件经优化后代谢的理化性质及对大豆疫霉的抑制作用。结果显示,发酵液不同使用浓度对大豆疫霉的抑制作用存在差异,使用浓度与抑菌率之间存在线性关系;经不同温度处理后,对大豆疫霉仍具有生物活性,具有热稳定性;p H值影响了代谢液的生物活性,其最适p H值为8.0,代谢液能够适应p H 7.0~9.0的弱碱性环境;不同生物酶处理过后,代谢液仍能保持活性,说明其产物可能是脂肽类化合物。代谢液对大豆疫霉菌丝的产量具有显著的抑制作用,代谢液处理过后,菌丝鲜重和干重严重下降;同时还能抑制游动孢子的萌发和芽管的伸长以及卵孢子的形成和大小。5生防菌BS-4对大豆疫霉侵染及大豆植株体内抗病酶系活性的影响测定了生防菌BS-4及其代谢液对大豆疫霉侵染大豆叶片及植株的抑制作用,同时还研究了生防菌BS-4处理大豆植株后,大豆植株体内与抗病性相关的PAL、POD和PPO的活性变化。结果显示,大豆疫霉的游动孢子和菌丝体在生防菌处理的叶片上的侵染受到明显影响,游动孢子在BS-4菌液前处理和后处理的叶片上均不能侵染,菌丝在前处理的叶片上不能侵染而在后处理的叶片上能轻微侵染。生防菌处理大豆植株后进行挑战接种大豆疫霉,结果显示,经生防菌BS-4处理后,大豆疫霉在接种部位仅能轻微发病,病斑不能扩展,植株生长良好,而对照组大豆严重发病,接种6 d后植株死亡。同时还发现,生防菌处理后再挑战接种大豆疫霉,植株体内的PAL、POD和PPO三个与抗性相关的酶类活性发生变化,接种3 d后三种酶的活性均达到顶峰,随后开始下降,到接种6 d时又有所上升,但幅度不大;同时还发现,生防菌BS-4单独处理过后,植株体内的PAL和POD活性能够显著上升,并能持续到第4 d,而PPO的活性升高不明显。这些结果说明生防菌BS-4诱导植物抗性是防治大豆疫霉的机理之一。6生防菌BS-4在大豆植株的定植及对根围微生物的影响测定了生防菌BS-4在大豆叶片及根际周围的定殖及对土壤微生物种群的影响。结果表明:生防菌BS-4能够在大豆叶片上定植,但持效期较短,仅能维持11d;接种7d后,在叶片上分离到的菌落数仅为8.0×105cfu/g,接种11 d后几乎检测不到生防菌BS-4的存在;但是生防菌BS-4在土壤中具有良好的生存能力,接种1 d后菌落数目出现一个高峰,之后逐渐降低当接种5 d后,其菌落数目达到稳定,之后菌落数目稳定在107数量级,上下略有浮动,但变化不大。同时生防菌BS-4接种后,对土壤中的真菌和细菌有一定的影响,真菌数目在接种初期有所下降,接种10 d后又有所回升;细菌数目在接种初期急剧上升,但在接种后期又趋于稳定;生防菌BS-4对放线菌的影响不大,其菌落数目未出现显著变化。