【摘 要】
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肠上皮屏障将肠腔中的细菌和病原体与宿主内环境进行分离,成为维持内环境稳态的关键。肠上皮细胞间紧密连接结构和功能缺陷及肠上皮细胞的异常凋亡会使肠上皮屏障通透性增高,造成肠腔内容物移位,引发多种肠道疾病的发生。通过调节紧密连接蛋白的表达和分布及预防肠上皮细胞的异常凋亡来增强肠上皮屏障功能是预防和治疗这些疾病的潜在靶点。国内外大量研究表明,乳酸菌具有增强肠黏膜屏障的益生功能,但从其物质分子角度深入解析其
【基金项目】
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国家重点研发计划项目“乳酸菌及发酵乳制品核心国家质量基础设施关键技术体系研究（2019YFF0217600）”; 上海乳业生物工程技术研究中心（19DZ2281400）
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肠上皮屏障将肠腔中的细菌和病原体与宿主内环境进行分离,成为维持内环境稳态的关键。肠上皮细胞间紧密连接结构和功能缺陷及肠上皮细胞的异常凋亡会使肠上皮屏障通透性增高,造成肠腔内容物移位,引发多种肠道疾病的发生。通过调节紧密连接蛋白的表达和分布及预防肠上皮细胞的异常凋亡来增强肠上皮屏障功能是预防和治疗这些疾病的潜在靶点。国内外大量研究表明,乳酸菌具有增强肠黏膜屏障的益生功能,但从其物质分子角度深入解析其保护机制仍然是当下的一个热点和难点。本研究利用Transwell细胞小室培养的Caco-2细胞单层,作为体外肠黏膜上皮屏障模型,通过检测乳酪杆菌属不同菌株发酵脱脂乳的无细胞上清对细胞单层跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance,TEER）和异硫氰酸荧光素-右旋糖苷（FITC-Dextran）的透过率的影响,筛选出一株能够降低细胞单层通透性,改善肠上皮屏障功能的副干酪乳酪杆菌BD5115,并进一步研究了该菌株增强肠上皮屏障功能的作用机制,最后对该菌株代谢产物中的效应物质进行了初探,为益生菌生物制剂的开发及肠上皮屏障损伤的防护提供了理论依据。结果如下:（1）乳酪杆菌属不同菌株对肠上皮屏障功能的调节作用具有菌株特异性。与对照组相比,干酪乳酪杆菌LC2W和副干酪乳酪杆菌BD5236的发酵乳上清对Caco-2细胞单层TEER值及FITC-Dextran的透过率无显著影响,副干酪乳酪杆菌BD3403和BD3407的发酵乳上清显著降低了Caco-2细胞单层TEER值和增高了FITC-Dextran的透过率（p＜0.05）,其余8株乳酪杆菌的发酵乳上清均不同程度增大了Caco-2细胞单层TEER值和降低了FITC-Dextran的透过率,其中,副干酪乳酪杆菌BD5115和干酪乳酪杆菌ATCC334对肠细胞单层TEER值及FITCDextran的透过率的影响最为显著,分别使肠细胞单层TEER升高了80.73±5.77%和69.41±5.30%,使FITC-Dextran的透过率降低了48.30±2.45%和41.68±3.93%。（2）与对照组相比,干酪乳酪杆菌ATCC334和副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清均能显著上调Caco-2细胞中Occludin和Claudins mRNA的表达,且对Occludin mRNA表达的上调幅度更大。另外,副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清对Occludin mRNA表达的上调作用显著优于ATCC334。（3）副干酪乳酪杆菌BD5115对肠上皮屏障功能的改善效果与其在脱脂乳中的发酵时间有关,发酵24h的BD5115发酵乳上清活性最强,显著优于6h的发酵乳上清。（4）副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清及其代谢物吲哚-3-甲醛可直接或间接的调节肠上皮屏障功能。首先,副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清不仅能直接提高Caco-2细胞中Occludin的mRNA表达量和改善Occludin蛋白在细胞膜上的分布,还能抑制LPS诱导的Caco-2细胞异常凋亡,缓解LPS引起的细胞中Occludin mRNA表达降低和Occludin蛋白在细胞膜上分布紊乱的现象。其次,与LPS诱导损伤的Caco-2细胞相比,副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清预处理可显著降低LPS诱导的Caco-2细胞中TLR4/NF-kB/MLCK信号通路相关基因和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达量。最后,副干酪乳酪杆菌BD5115发酵脱脂乳产生的吲哚-3-甲醛对肠上皮屏障功能的调节作用具有与副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清相似的效果。以上结果表明,乳酪杆菌属不同菌株对肠上皮屏障功能的调节作用具有菌株特异性。其中,副干酪乳酪杆菌BD5115发酵乳上清不仅能直接提高Caco-2细胞中Occludin的mRNA表达量和改善Occludin蛋白在细胞膜上的分布,还能通过抑制LPS引起的TLR4/NF-kB/MLCK信号通路的活化和细胞异常凋亡预防LPS诱导的肠屏障损伤。其代谢产物吲哚-3-甲醛可能是其改善肠上皮屏障功能的效应物质之一。
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