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背景及目的：
临床上外伤、牙髓病、根尖周病等原因造成牙缺失后，牙槽骨会发生不同程度的吸收，这往往对后期的种植修复造成不利影响，如何有效地维持牙缺失后牙槽嵴的骨量逐渐引起临床上种植修复科医生的重视。目前临床上常用颗粒状的骨替代材料填充拔牙后的牙槽窝，但这些材料在孔隙及形状上无法进行精确控制，力学上无法对牙槽窝形成有效的支撑，在促进成骨的生物学性能上也往往无法同时满足拥有骨形成、骨诱导及骨传导三种作用的条件。因此，课题组希望通过骨组织工程技术在现有的基础条件上制作一种新型的、拥有更加优良性能的骨替代材料。磷酸三钙（tricalciumphosphate，TCP）的物理、化学性能以及生物相容性与人正常骨组织中的羟基磷灰石十分相近，具有良好的骨传导性及可降解性，在降解时释放的钙离子与磷酸根离子可参与局部体液循环，并被周围骨组织利用，有助于新骨形成。乳牙牙髓干细胞作为一种间充质干细胞，具有成脂、成骨、成神经等多项分化潜能，是作为骨组织工程的理想种子细胞。3D打印技术的出现可以将支架材料塑造为临床所需的个性化形态，并在其中塑造多孔结构来加强组织工程种子细胞的附着环境。因此，本研究将分为第一部分及第二部分，第一部分旨在通过体外SHED细胞与3D打印TCP材料相容性试验，验证材料性能及其与SHED结合后应用于体内的可能性。第二部分使用第一部分中的3D打印技术，将拥有优良骨传导作用的TCP材料制作成规则孔隙结构的个性化牙根支架，同时通过接种SHED赋予其骨形成、骨诱导能力，探究其在比格犬位点保存术上的作用效果。
第一部分SHED的分离培养及3D打印TCP牙根支架的初步生物学评价
材料与方法：
通过锥形束投照计算机重组断层影像（cornbeancomputedtomography，CBCT）采集比格犬下颌骨数据，使用mimics软件提取其第二前磨牙至第四前磨牙牙根数据，生成STL文件，使用自动注浆技术打印TCP牙根支架。扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）观察支架表面形态及孔隙率。采用人乳牙牙髓干细胞SHED与支架复合培养进行生物相容性检测。将TCP牙根支架切块消毒灭菌干燥后备用，将SHED细胞接种在支架表面，通过活死染色试剂盒观察不同时间点材料表面细胞黏附情况；Alarmarblue试剂盒检测支架上的SHED1、3、5、7d增殖状态；ALP试剂盒检测支架浸提液对SHED成骨活性的影响。
结果：
3D打印的TCP支架具有规则的三维孔隙结构，SEM检测到支架侧壁及横断面孔径分别为50-100μm、350-400μm，Micro-CT检测TCP支架孔隙率为53.34±15.12%，活死染色实验发现4h后SHED即可稳定粘附于TCP支架上，7d后细胞仍与支架附着良好，红染的死细胞数量较少；Alarmablue结果显示细胞接种至TCP支架后活性在1、3、5、7d逐渐提高；ALP实验显示第7d时TCP浸提液组SHED的ALP活性较空白组高（P<0.05）。
结论：
TCP支架具有规则的孔隙结构，符合作为组织工程支架的条件；SHED可稳定粘附于3D打印的TCP支架上，在支架上能正常生长增殖；TCP支架材料的生物相容性良好并可促进SHED的成骨向分化。
第二部分3D打印TCP牙根联合SHED应用比格犬位点保存术效果研究
材料与方法：
分组，将实验一中打印的个性化TCP牙根接种或不接种SHED后在矿化培养基中成骨诱导一周，对应植入拔完牙后的比格犬牙槽窝内，术后即刻、术后5周、术后11周进行骨荧光素的注射来追踪骨改建情况；术后1周、6周、12周分别进行CBCT的拍摄观察其牙槽嵴宽度及高度的变化；13周处死，取样进行Micro-CT扫描分析其牙槽窝组织成分比例，最后将样品脱水包埋，通过硬组织切磨技术制作组织学切片观察其组织学结构，并分别与空白对照组间进行比较，探究SHED和3D打印TCP牙根对于比格犬位点保存术的作用效果。
结果：
CBCT结果显示在颊侧骨板高度变化上第6周时单纯TCP组及TCP+SHED组较对照组少，第12周时单纯TCP组少于对照组，TCP+SHED组少于TCP组及对照组（P<0.001）；舌侧骨板高度第6、12周时三组间均无统计学差异（P>0.05）；在舌侧牙槽嵴顶水平宽度变化上第6周时TCP组低于对照组，SHED+TCP组低于单纯TCP组及对照组，第12周时TCP+SHED组低于单纯TCP组及对照组（P<0.05）;在舌侧牙槽嵴顶下2mm处牙槽嵴水平宽度变化上第12周时TCP+SHED组低于对照组（P<0.05）；在舌侧牙槽嵴顶下4mm处牙槽嵴水平宽度变化上6周及12周时三组间均无统计学差异；Micro-CT结果显示在冠方骨组织占比TCP+SHED组多于单纯TCP组及对照组（P<0.05）；根中区骨组织占比TCP+SHED组与单纯TCP组多于对照组（P<0.05）；根尖区骨组织占比TCP+SHED组与单纯TCP组多于对照组（P<0.01）；组织切片结果显示骨荧光标记后三组新生骨组织在激光激发下均有红、绿及橙色荧光显现，其中红、绿荧光较为明显，绿色较多，HE染色结果骨组织染色与荧光结果一致。
结论：
单纯TCP牙根支架对牙槽嵴的骨量尤其是颊侧骨板有保存作用，这个作用在加入SHED后有了显著增强；同时TCP材料与SHED对于牙槽窝内骨组织的形成均有促进作用，证明个性化3D打印牙根TCP支架联合SHED作为临床位点保存术的骨替代材料是可行的，同时提示这种方法有在临床其他骨缺损修复中应用的可能。
临床上外伤、牙髓病、根尖周病等原因造成牙缺失后，牙槽骨会发生不同程度的吸收，这往往对后期的种植修复造成不利影响，如何有效地维持牙缺失后牙槽嵴的骨量逐渐引起临床上种植修复科医生的重视。目前临床上常用颗粒状的骨替代材料填充拔牙后的牙槽窝，但这些材料在孔隙及形状上无法进行精确控制，力学上无法对牙槽窝形成有效的支撑，在促进成骨的生物学性能上也往往无法同时满足拥有骨形成、骨诱导及骨传导三种作用的条件。因此，课题组希望通过骨组织工程技术在现有的基础条件上制作一种新型的、拥有更加优良性能的骨替代材料。磷酸三钙（tricalciumphosphate，TCP）的物理、化学性能以及生物相容性与人正常骨组织中的羟基磷灰石十分相近，具有良好的骨传导性及可降解性，在降解时释放的钙离子与磷酸根离子可参与局部体液循环，并被周围骨组织利用，有助于新骨形成。乳牙牙髓干细胞作为一种间充质干细胞，具有成脂、成骨、成神经等多项分化潜能，是作为骨组织工程的理想种子细胞。3D打印技术的出现可以将支架材料塑造为临床所需的个性化形态，并在其中塑造多孔结构来加强组织工程种子细胞的附着环境。因此，本研究将分为第一部分及第二部分，第一部分旨在通过体外SHED细胞与3D打印TCP材料相容性试验，验证材料性能及其与SHED结合后应用于体内的可能性。第二部分使用第一部分中的3D打印技术，将拥有优良骨传导作用的TCP材料制作成规则孔隙结构的个性化牙根支架，同时通过接种SHED赋予其骨形成、骨诱导能力，探究其在比格犬位点保存术上的作用效果。
第一部分SHED的分离培养及3D打印TCP牙根支架的初步生物学评价
材料与方法：
通过锥形束投照计算机重组断层影像（cornbeancomputedtomography，CBCT）采集比格犬下颌骨数据，使用mimics软件提取其第二前磨牙至第四前磨牙牙根数据，生成STL文件，使用自动注浆技术打印TCP牙根支架。扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）观察支架表面形态及孔隙率。采用人乳牙牙髓干细胞SHED与支架复合培养进行生物相容性检测。将TCP牙根支架切块消毒灭菌干燥后备用，将SHED细胞接种在支架表面，通过活死染色试剂盒观察不同时间点材料表面细胞黏附情况；Alarmarblue试剂盒检测支架上的SHED1、3、5、7d增殖状态；ALP试剂盒检测支架浸提液对SHED成骨活性的影响。
结果：
3D打印的TCP支架具有规则的三维孔隙结构，SEM检测到支架侧壁及横断面孔径分别为50-100μm、350-400μm，Micro-CT检测TCP支架孔隙率为53.34±15.12%，活死染色实验发现4h后SHED即可稳定粘附于TCP支架上，7d后细胞仍与支架附着良好，红染的死细胞数量较少；Alarmablue结果显示细胞接种至TCP支架后活性在1、3、5、7d逐渐提高；ALP实验显示第7d时TCP浸提液组SHED的ALP活性较空白组高（P<0.05）。
结论：
TCP支架具有规则的孔隙结构，符合作为组织工程支架的条件；SHED可稳定粘附于3D打印的TCP支架上，在支架上能正常生长增殖；TCP支架材料的生物相容性良好并可促进SHED的成骨向分化。
第二部分3D打印TCP牙根联合SHED应用比格犬位点保存术效果研究
材料与方法：
分组，将实验一中打印的个性化TCP牙根接种或不接种SHED后在矿化培养基中成骨诱导一周，对应植入拔完牙后的比格犬牙槽窝内，术后即刻、术后5周、术后11周进行骨荧光素的注射来追踪骨改建情况；术后1周、6周、12周分别进行CBCT的拍摄观察其牙槽嵴宽度及高度的变化；13周处死，取样进行Micro-CT扫描分析其牙槽窝组织成分比例，最后将样品脱水包埋，通过硬组织切磨技术制作组织学切片观察其组织学结构，并分别与空白对照组间进行比较，探究SHED和3D打印TCP牙根对于比格犬位点保存术的作用效果。
结果：
CBCT结果显示在颊侧骨板高度变化上第6周时单纯TCP组及TCP+SHED组较对照组少，第12周时单纯TCP组少于对照组，TCP+SHED组少于TCP组及对照组（P<0.001）；舌侧骨板高度第6、12周时三组间均无统计学差异（P>0.05）；在舌侧牙槽嵴顶水平宽度变化上第6周时TCP组低于对照组，SHED+TCP组低于单纯TCP组及对照组，第12周时TCP+SHED组低于单纯TCP组及对照组（P<0.05）;在舌侧牙槽嵴顶下2mm处牙槽嵴水平宽度变化上第12周时TCP+SHED组低于对照组（P<0.05）；在舌侧牙槽嵴顶下4mm处牙槽嵴水平宽度变化上6周及12周时三组间均无统计学差异；Micro-CT结果显示在冠方骨组织占比TCP+SHED组多于单纯TCP组及对照组（P<0.05）；根中区骨组织占比TCP+SHED组与单纯TCP组多于对照组（P<0.05）；根尖区骨组织占比TCP+SHED组与单纯TCP组多于对照组（P<0.01）；组织切片结果显示骨荧光标记后三组新生骨组织在激光激发下均有红、绿及橙色荧光显现，其中红、绿荧光较为明显，绿色较多，HE染色结果骨组织染色与荧光结果一致。
结论：
单纯TCP牙根支架对牙槽嵴的骨量尤其是颊侧骨板有保存作用，这个作用在加入SHED后有了显著增强；同时TCP材料与SHED对于牙槽窝内骨组织的形成均有促进作用，证明个性化3D打印牙根TCP支架联合SHED作为临床位点保存术的骨替代材料是可行的，同时提示这种方法有在临床其他骨缺损修复中应用的可能。