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目的:
1.构建鹅源金黄色葡萄球菌eap靶基因原核表达载体，并初步研究目的蛋白的免疫学活性及其应用。
2.金黄色葡萄球菌eap靶基因双重PCR检测方法的建立。
方法:
1.依据Genebank中公布的eap基因全长信息，PCR扩增内蒙古鹅源分离株的eap基因片段，将纯化回收后的目的片段克隆到pMD18-TVector载体上，经实验室PCR扩增和单双酶切鉴定，鉴定正确后测序分析。测序分析正确后构建pET28a-eap重组质粒并转化到大肠杆菌E.coliBL21中。经IPTG诱导SDS-PAGE鉴定成功后，用Ni-NTA亲和柱获取的纯化的Eap蛋白和全菌体灭活菌苗分别免疫家兔，应用Western-blot方法检测重组Eap蛋白的免疫活性。建立间接ELISA方法，研究目的蛋白的反应原性。
2.以金黄色葡萄球菌的eap基因为靶基因设计引物，通过PCR扩增技术检测100株由临床采集并分离的细菌。首先对临床采集的100株标本进行分离纯化并根据生物学特性进行大致区分。通过国际公认的葡萄球菌特异性基因16srRNA与金黄色葡萄球菌特异性eap基因序列双重分析法鉴定，其中有57株为目的菌。
结果:
1.成功构建pET28a-eap/BL21，在pET28a(+)系统中成功表达了Eap融合蛋白，获得小量纯化的Eap重组目的蛋白。
2.成功应用葡萄球菌特异性基因16srRNA和金黄色葡萄球菌特异性eap基因为检测靶点，建立一种能快速灵敏的检测病原菌的双重PCR检测方法。
结论:
1.在pET28a系统中成功表达了Eap融合蛋白并小量纯化，为进一步研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定相关的理论基础。
2.应用eap基因作为一种具体的诊断工具用于标识目的致病菌。为从分子水平上快速鉴定病原菌提供了简单、快速、准确的方法。