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目的:反常性痤疮(Acne inversa,AI;OMIM 142690)又称化脓性汗腺炎(Hidradenitis suppurativa,HS),主要由γ-分泌酶基因突变引起,其中NCSTN亚基突变占绝大多数。本课题通过慢病毒介导的RNA干扰技术构建了 NCSTN基因稳定沉默的人永生化角质细胞HaCaT细胞模型,RNA测序方法检测干扰组与阴性对照组两组细胞的基因表达,生物信息学筛选出差异表达的信号通路、炎症因子和细胞增殖分化相关的分子,通过检测HaCaT细胞中信号通路、炎症因子及增殖分化表达的改变,初步探究NCSTN基因突变引起家族性AI的可能机制。方法:1.用靶向NCSTN基因的慢病毒介导的短发卡RNA(shRNA)表达质粒感染人永生化角质细胞HaCaT细胞。将细胞分为阴性对照组(NC组)和干扰组(shRNA组),流式细胞仪检测转染效率,Real-Time PCR和Western blotting检测NCSTN基因的干扰效率。2.RNA测序方法检测NCSTN基因稳定干扰的HaCaT细胞基因表达,通过生物信息学选出改变的信号通路、炎症和细胞增殖、分化有关的分子。3.Real-Time PCR 和 Western blotting 检测γ-分泌酶四个亚基、Notch-Hes 信号通路分子的表达变化。4.检测 IL-36 细胞因子的表达量(IL-36α、IL-36β、IL-36γ 和 IL-36Ra)。检测下游NF-k B通路表达情况。5.CCK-8法检测细胞增殖,Real-Time PCR和Western blotting检测细胞角蛋白(CK1、CK5、CK7、CK10、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19、CK20)及其他分化因子(IVL、LOR)的表达。结果:1.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测NC组和shRNA组慢病毒转染效率均大于90%,与NC组相比,干扰组NCSTN基因mRNA和蛋白表达量明显降低。2.RNA测序发现多种差异表达的基因、信号通路。选取Notch-Hes信号通路,IL-36及增殖分化因子作为后续研究的方向。3.NCSTN基因稳定干扰后,NCSTN亚基、PSENEN亚基及PSEN的活性片段PS1-CTF表达较对照组表达明显下降,PSEN亚基全长、APH1A亚基表达无改变。Notch-Hes信号通路的Notch3、Hes1表达降低。4.IL-36细胞因子中IL-36 a、IL-36 β水平明显升高,IL-36Ra的水平明显降低,而IL-36 γ水平并无明显差异。下游NF-κB通路表达无改变。5.CCK-8结果显示干扰组较对照组的角质细胞明显增殖活跃,细胞角蛋白CK16、CK19表达下降,终末分化分子IVL表达明显降低,细胞出现异常分化。结论:初步探究了干扰NCSTN基因导致家族性AI的机制。1.成功构建了 NCSTN基因稳定干扰的人永生化角质细胞HaCaT细胞模型。2.RNA测序筛选出Notch信号通路下调,IL-36分子及增殖分化因子发生变化。3.NCSTN基因干扰后,γ-分泌酶-Notch-Hes信号通路下调。4.NCSTN基因干扰后角质细胞发生IL-36细胞因子失衡。下游NF-κB通路没有改变。5.NCSTN基因干扰后角质细胞增生活跃和异常分化。