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研究背景成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast activation protein, FAPa)是1986年由国外的学者Rettig等应用单克隆抗体F19(用体外培养的人成纤维细胞免疫小鼠获得)从人类恶性黑色素瘤细胞株LOX当中识别的一种膜结合糖蛋白,它特异性表达活化的成纤维细胞(Fibroblast, FB)膜上,在正常成人静息的FB上通常不表达或者表达水平很低。提示：FAPa是活化FB表面的标志物,在控制FB生长及胚胎发育、组织修复和上皮性肿瘤的演进过程中可能起一定的作用。近三十年来,国内外有关FAPa的研究工作逐渐开展,大部分集中在组织器官纤维化和上皮性肿瘤的研究领域。大量的研究报道,FAPa在大多数上皮性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用,其作用机制有以下几种可能：(1)发挥其酶的功能,直接溶解与其相邻的细胞外基质成分,协助肿瘤细胞的侵袭和参与肿瘤组织的重塑；(2)解离与基质蛋白结合的生长因子,使之发挥促生长作用；(3)参与肿瘤微血管的生成。目前FAPa已成为肿瘤治疗的新型靶目标,成为肿瘤临床与基础研究的热点,相关研究工作正在有序地开展,其中的不足之处仍在不断改进。FB作为重要的组织修复细胞,以活化的形式参与创面修复的各个阶段,在创面修复过程中起重要的作用。FAPa作为活化FB表面的标志物,目前有关FAPa在创面修复与组织重建的研究领域开展较少,目前虽然已经明确FAPa在创面修复的早期阶段及后期的瘢痕组织中均有不同程度的表达,但是FAPa在创面修复过程中的动态表达特点、生理作用及调控机制,迄今未见系统的研究和阐明。研究目的1.观测FAPa在大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复过程中的动态表达特点。2.观测FAPa在成人病理性瘢痕组织中的表达特点。3.初步探讨FAPa在烫伤创面修复过程中可能的作用。材料与方法1.实验动物分组：健康成年清洁级Wistar大鼠共48只,雌雄不限,体质量200-220g(南方医科大学动物实验中心提供)。按统计学分组要求,随机分为对照组和实验组,对照组6只,实验组42只。实验组分为烫伤后6h、12h,1d、3d、7d、14d、21d7个分组,每分组6只。2.深Ⅱ度烫伤模型的建立与组织获取：Wistar大鼠烫伤模型借鉴文献设计,于实验前一天背部脱毛,0.3%戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉。室温下,将盛有56ml去离子水,直径约3.0cm的烧瓶放入恒温水箱中,加热至烧瓶内的温度为95℃时取出烧瓶,在温度为90℃时,轻放在大鼠背部皮肤上15s,造成直径约3.0cm大小的圆形深Ⅱ度烫伤创面(经病理验证为深Ⅱ度烫伤创面)。伤后大鼠置室温25℃环境中分笼饲养,自由饮水、进食,每天更换创面敷料一次。分别在伤后预定时间断头处死,取创面中央处1.0cm×1.Ocm全层皮肤组织,1/2放入4%中性多聚甲醛中固定,用于免疫组织化学实验,另1/2组织置于-80℃冰箱保存,用于Western blotting检测试验。对照组背部脱毛后直接断头处死,取与实验组大鼠相同部位同等大小皮肤组织进行实验。3.病理性瘢痕组织的获取：选择南方医院烧伤科因四肢深Ⅱ度烫伤后形成病理性瘢痕,需要手术治疗的患者6例(诊断依靠病史及病理检查,病变局部皮肤无破溃,患者无全身疾病),男女各半,年龄18-60岁,瘢痕形成时间10-14个月。在征得病人及其家属同意后,手术切除病理性瘢痕的同时,在其周边取少许正常皮肤组织作对照,标本置于-80℃冰箱保存,用于Western blotting检测实验。4.观测方法：应用免疫组织化学技术和Western blotting技术对FAPa的表达进行定位和半定量检测。5.统计学处理：数据用SPSS13.0软件处理,计量资料以均数±标准差表示,对大鼠烫伤创面FAPa的灰度值行正态分布检验和方差齐性检验,符合正态分布、方差齐性。对大鼠烫伤创面修复过程中不同时间点FAPa的灰度值的统计分析采用one-way ANOVA,进一步多重比较采用SNK-q检验；成人病理性瘢痕组织及其周围正常皮肤组织FAPa灰度值的统计分析,采用配对t检验。显著性检验水平α=0.05,当P<0.05时,差异有统计学意义。实验结果1.免疫组织化学技术测得FAPa (+)的成纤维细胞被DAB染成棕色定位在创面真皮血管以及新生血管的血管壁和血管周围。2.以β-actin为内参,Western blotting技术测得对照组与实验组各时间点大鼠背部皮肤组织FAPa的灰度值分别为31.67±3.20,84.67±8.71,106.00±11.75,118.33±13.44,117.33±8.62,140.33±15.92,106.17±15.77,79.83±9.30。实验组各时间点FAPa的灰度值与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组各时间点FAPa灰度值的总体均数不全相等,其中12h与1d,1d与3d比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余时间点FAPa的灰度值与相邻时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.以β-actin为内参,Western blotting技术测得成人正常皮肤组织与病理性瘢痕组织中FAPa的灰度值分别为18.00±7.87,47.17±10.09,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1. FAPa在大鼠正常皮肤组织中也有表达,深Ⅱ度烫伤后6h, FAPa的表达量已明显增多,6h以后FAPa的表达量逐渐增多,并在烫伤后第7d达到高峰,7d后FAPa的表达量逐渐减少,至伤后第21d FAPa仍有较高水平的表达。2. FAPa在成人正常皮肤与病理性瘢痕组织中均有表达,病理性瘢痕组织中的表达量高于正常皮肤组织。3. FAPa在深Ⅱ度烫伤创面修复过程中的表达特点与创面修复的炎症反应、细胞增殖、创面收缩和再塑形几个阶段成纤维细胞的活动特点存在密切关系。提示,FAPa在烫伤创面修复过程中起一定作用。