乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤,具有极高的致死性,是广大医疗学者头号难题。不仅仅是人类,目前宠物犬猫也容易高发乳腺肿瘤,这对于开发乳腺癌新疗法以及更准确的诊断和预后方法仍然是一个很大的挑战。因此,我们为了更加清楚乳腺肿瘤的发生发展的生物学机制,就需要寻找一种新型的治疗靶标。mi RNA在多种体液中的表达量相对稳定,是目前研究恶性肿瘤的生物标记物的热点。目前mi RNA已经被证实与多种癌症有着重要的关系,其不仅能够发挥抑癌基因的功能,还具有原癌基因的功能。原癌mi RNA在肿瘤中高表达,会促进肿瘤的发生、增长、侵袭等,发挥正向调控作用,抑癌mi RNA则与之相反。了解/阐明mi RNA的分子调控机制有助于我们全面地了解乳腺肿瘤的发生发展,对进一步认识和理解乳腺癌发生的潜在分子机制提供了科学理论依据。因此,mi RNA可以当做乳腺肿瘤潜在的生物标志物,会为今后对癌症的治疗提供一种新手段。据相关报道,micro RNA-188-5p(mi R-188)参与并调节肝癌以及胃癌中相关癌细胞的侵袭和转移的过程。然而,关于mi R-188是否参与乳腺癌发生发展,及其参与乳腺癌内在分子机制的调节还不是很明确。在本试验研究中,旨在使用分子生物学技术等,从兽医临床收集到的样本、小鼠移植瘤模型以及乳腺癌细胞等多角度深入探讨参与调节乳腺癌发生机制的Rap2c基因。深入分析mi R-188以及Rap2c基因之间的关系,以及对乳腺癌细胞增殖和转移等多个方面的相互作用机制。MAPK信号通路已经被证实在许多生物学行为中起着十分重要的作用,其中Ras基因参与Ras-MAPK信号通路,调控细胞的增殖和恶性转化等。Rap2c是Ras家族的小G蛋白,已经有报道称Rap2c可通过激活MAPK信号通路,最终会影响相关癌细胞的生理进程。尽管一些研究证实了Rap2c与癌症的发生发展密切相关,然而截至目前为止,关于Rap2c基因在乳腺癌中的相关调节作用的研究还很少。为明确mi R-188和Rap2c与乳腺癌发生发展的关系,本论文旨在研究mi R-188和Rap2c对乳腺癌凋亡的作用和其潜在分子机制,拟从以下方面进行研究:1.动物实验:建立小鼠移植瘤模型,通过实时定量qRT-PCR检测mi R-188在犬乳腺癌肿瘤以及瘤旁组织中的表达水平,以及在小鼠移植瘤模型中的表达水平。2.体外实验:在细胞体外转染mi R-188 mimics及inhibitor,对mi R-188进行过表达和抑制。运用CCK-8、流式细胞术、划痕实验和蛋白免疫印迹等技术进行mi R-188和Rap2c的功能验证;利用酶切等技术成功构建荧光素酶质粒:预测靶基因Rap2c3’端非编码区结合位点的野生型和突变型质粒,通过体外共转染技术来验证mi R-188的靶基因是否正确;运用免疫荧光和蛋白免疫印迹技术确定mi R-188对MAPK通路中关键性蛋白的影响。结果:mi R-188在犬乳腺肿瘤组织和小鼠乳腺移植瘤中显著性低表达。mi R-188过表达后能够显著性地诱导乳腺癌细胞的凋亡过程,mi R-188还能够抑制癌细胞的增殖及迁移,通过软件和双荧光素酶报告分析件预测验证发现Rap2c是mi R-188的靶基因。通过体外细胞实验对靶基因进行验证发现沉默Rap2c可以抑制乳腺癌细胞的生长和迁移,而且促进乳腺癌细胞的凋亡过程。蛋白免疫印迹实验验证mi R-188显著抑制了MAPK信号通路中的ERK、JNK以及p38主要蛋白的磷酸化,并且免疫荧光结果也同样显示mi R-188抑制了MAPK信号通路中p38蛋白的磷酸化过程。mi R-188可以通过作用于Rap2c/MAPK信号通路来发挥抑制乳腺癌的作用。结论:在乳腺癌细胞中,mi R-188通过靶向负调控Rap2c抑制MAPK信号通路的激活,从而抑制乳腺癌细胞迁移和增殖的作用。总而言之,mi R-188作为乳腺癌生物标记物,有望成为乳腺癌新的临床诊断和治疗指标。