基于高负载纳米氧化锌的果品重点真菌毒素电化学传感器研究

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真菌毒素(Mycotoxins)是农作物尤其是粮油作物中污染范围最广、危害最大的一类物质,一直受到广泛的关注。随着人们生活水平的提高,对新鲜水果及其制品的食用需求量不断增加,果品易霉易腐不耐贮存的特性使得其受到真菌毒素污染的风险不断加大。但不同于粮油作物,果品中的这种污染常被低估和忽视。研究发现,在果品中污染最为广泛,危害最大的重点真菌毒素是展青霉素(Patulin,PAT)和细交链格孢菌酮酸(Tenuazonic Acid,TeA),它们会对人类和动物的健康构成威胁,因此对其准确识别和检测是控制果品中真菌毒素污染的首要和关键环节。由于成分的差异,果品中存在的真菌毒素种类、含量范围与粮油作物有很大不同,并且果品中含有果胶、色素等复杂基质成分,常规检测技术用于果品时,检测范围、准确性、灵敏度等都会受到影响,同时,鲜果中水分含量较大,造成以鲜重计算的真菌毒素污染浓度相对较低。因此,需要对水果及其制品开发针对性的真菌毒素高灵敏度检测技术。氧化锌(Zinc oxide,ZnO)是一种通用半导体材料,兼具纳米材料和半导体材料的双重性能,拥有比表面积大、稳定性强、生物相容性好、易合成、价格低廉等优势。在化学合成过程中,ZnO晶体生长形态多样且易受合成条件的影响,通过控制影响因素使其生长为目标形态,可以满足不同的使用需求,为ZnO纳米材料的更广泛应用提供了可能。本研究旨在探索ZnO纳米材料水热合成的生长规律,并比较不同形态的ZnO纳米材料对适配体和单克隆抗体等生物材料的负载能力,挑选出适合不同真菌毒素和果品检测环境的ZnO纳米材料,接着利用ZnO纳米材料比表面积大、生物相容性好的优势,在电化学反应界面引入大量的核酸适配体和单克隆抗体等生物识别元件,分别构建PAT、TeA的电化学检测方法。主要的研究内容及结果如下:(1)六水合硝酸锌[Zn(NO32·6H2O]作为锌源,氢氧化钠(NaOH)和氨水(NH3·H2O)作为碱源,水热法合成ZnO纳米材料,通过改变pH、反应温度、反应时间、沉淀剂类型等反应条件,探究反应条件与制备的ZnO纳米材料形态变化及趋势的关系,达到ZnO的可控合成。结果发现,随着pH和反应温度的升高,ZnO纳米材料形态分别由颗粒和片层状趋向棒状生长;沉淀剂碱性越强,越有利于ZnO生成棒状结构。其中,“刷状”和“花状”两种形态的Zn O纳米材料(以下称“ZnO纳米刷”和“ZnO纳米花”)表面粗糙,排布立体,且每个单体表面均存在大量的空隙,比表面积大,具有较大应用潜力。研究其对生物识别材料(PAT适配体和抗TeA单克隆抗体)的负载能力,结果表明,PAT适配体适合负载于ZnO纳米刷材料表面;抗TeA单克隆抗体适合负载于ZnO纳米花材料表面。(2)将高负载性的ZnO纳米刷修饰于金电极表面,再以此为负载平台与PAT特异性适配体相结合,以修饰化金电极作为工作电极,甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,构建三电极体系,以此构建PAT的电化学适配体传感器,并将其应用于苹果汁、山楂片等水果制品中PAT的高灵敏度检测。研究发现,金电极表面氧化锌-壳聚糖(ZnO-CS)分散液修饰体积2μL,适配体修饰浓度8μM,修饰时间45 min,5%的牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)溶液封闭时间45 min,此时利用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)进行电化学信号检测,传感器性能达到最优。该方法检测PAT样液,检测范围在5×10-4μg/m L~1μg/mL之间,线性回归方程为y=3.10lgC+37.34,R2=0.98,最低检出限为1.51×10-4μg/m L;相对标准偏差为2.51%~5.09%;在苹果汁和山楂片中的平均加标回收率为94.75%~110.84%;对于AFB1、OTA、T-2、ZEN、FB1等常见的真菌毒素具有较好的抗干扰能力。(3)本研究将高负载性的ZnO纳米花与抗TeA单克隆抗体共价偶联,共同修饰于金电极表面,以修饰化金电极作为工作电极,甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,构建出三电极体系,利用ZnO纳米花材料比表面积大的特点,增强电化学反应平台对单克隆抗体的负载能力,以此为基础构建TeA的电化学免疫传感器,开发果品中TeA的高灵敏检测方法。研究发现,1%硫代水杨酸(Thiosalicylic acid,MBA)的乙醇溶液修饰电极时间2 h,氧化锌-单克隆抗体(ZnO-mAb)复合物的修饰浓度0.8 mg/m L,修饰时间2.5 h,5%的BSA溶液封闭时间1.5 h,此时利用DPV进行电化学信号检测,传感器性能达到最优。该方法检测TeA样液,检测范围为5×10-5μg/mL~5×10-1μg/mL,回归方程为y=1.35lgC+25.67,R2=0.99;最低检出限为1.14×10-5μg/mL;五组重复实验的相对标准偏差为3.05%~6.31%;在番茄、柑橘等样品中的平均加标回收率为95.71%~120.30%;对于与TeA结构相似的四种链格孢菌毒素ALT、AME、TEN、AOH具有一定的抗干扰能力。
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