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【研究背景与目的】肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其中很大部分(85%)是非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)。目前NSCLC的远期治疗效果仍然不理想,NSCLC进展期发生肿瘤转移是导致治疗失败的主要原因。因此发现并阐明肺癌发生侵袭和转移过程中的分子机制对提高患者的生存率非常重要。转化生长因子-beta信号通路(TGF-βsignal pathway)介导的上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肺癌的侵袭转移过程中起到了十分关键的作用。TGF-β信号通路在肿瘤细胞中的作用受到多种机制调节,近年来非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在基因表达调控中的作用日益受到重视。X染色体失活基因(X inactivate-specific transcript,XIST)与多种肿瘤的发生发展密切相关,有研究表明XIST在NSCLC中表达上调,且在促进NSCLC细胞迁移和侵袭过程中发挥作用。本研究旨在探讨XIST促进TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT过程的作用机制,阐明XIST与miRNA的相互作用在NSCLC侵袭转移过程中的重要作用,为NSCLC的诊断和治疗提供新的思路和实验依据。【研究方法】(1)实时定量荧光PCR检测在不同转移状态的非小细胞肺癌患者中XIST和ZEB2 mRNA的表达情况表达情况,同时检测miR-367-3p、miR-141-3p及ZEB2mRNA在NSCLC细胞株与正常支气管上皮细胞株中的表达情况。(2)分别敲低XIST或ZEB2和过表达miR-367-3p或miR-141-3p后,western blot检测对TGF-诱导的EMT过程中关键分子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达量的影响,Transwell实验检验对NSCLC细胞迁移和侵袭表型的影响。(3)生物信息学软件预测分析能够靶向XIST和ZEB2 mRNA的microRNA,构建双荧光报告载体,双荧光素酶活性实验验证相关microRNA是否与XIST和ZEB2区域的种子序列直接结合。(4)Anti-AGO2 RIP实验验证RNA诱导沉默复合体(RISC)上是否富集相关microRNA与lncRNA。(5)体内实验验证在A549中敲低XIST对裸鼠肺部肿瘤转移的影响。【研究结果】(1)实时定量PCR法检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织中XIST和ZEB2的表达水平,结果显示XIST在有淋巴结转移组的NSCLC组织中的表达明显高于无淋巴结转移组(P<0.01),与此同时ZEB2在有淋巴结转移组的NSCLC组织中的表达也明显高于无淋巴结转移组(P<0.01)。(2)与正常支气管上皮细胞(HBE)比较,miR-367-3p和mi R-141-3p的表达水平在非小细胞肺癌细胞株中呈现出不同程度的下调,且在高转移的95D细胞表达水平较低转移的95C细胞更低。ZEB2 mRNA的表达水平在非小细胞肺癌细胞株中呈现出不同程度的上调。(3)敲弱XIST表达能够显著抑制TGF-β诱导的A549和H226细胞的EMT过程。(4)生物信息学预测XIST以及ZEB2 m RNA同时存在结合位点的2个miRNA:miR-367-3p与miR-141-3p。双荧光实验证明miR-367-3p和mi R-141-3p可分别通过与XIST、ZEB2mRNA 3’UTR区相结合进而发挥相互作用。Anti-AGO2 RIP实验证实miR-367-3p或miR-141-3p与XIST均存在直接作用关系。Western blot实验检测miR-367-3p或miR-141-3p可显著抑制ZEB2在NSCLC细胞中的表达。(5)在NSCLC细胞株中敲弱ZEB2表达可以抑制TGF-β诱导的EMT过程。(6)MiR-367-3p和miR-141-3p能够通过靶向ZEB2抑制NSCLC细胞中TGF-β诱导的EMT过程。(7)体内实验证明敲低XIST可以抑制NSCLC细胞的肺部转移。【结论】我们的研究表明lncRNA XIST能够通过调控miR-367/miR-141-ZEB2轴促进NSCLC细胞中TGF-β介导的EMT过程以及NSCLC的侵袭和转移,XIST可能成为进展期NSCLC诊断和治疗的新靶点。