研究背景结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一,然而在结直肠癌相关性死亡中,大部分为转移癌所致。近年来越来越多的研究聚焦于肿瘤转移,并不断探索肿瘤转移的机制,旨在减少肿瘤转移的发生,降低转移癌的死亡率。肿瘤血管生成是肿瘤生长以及肿瘤转移过程中非常重要的环节,VEGF是促进血管生成的重要因子,在肿瘤血管生成中也具有重要作用。目前有实验通过抑制VEGF的生成来抑制肿瘤血管形成,从而抑制肿瘤,但是对于结直肠癌的转移抑制作用不明显。因此,有必要进一步研究VEGF在结直肠癌形成以及转移过程中的机制。近年来,研究发现Lgr5为小肠、结肠以及毛囊等组织的干细胞特异性分子标记物,并且在肝细胞癌、结肠癌、卵巢癌、基底细胞癌以及胃癌等实体肿瘤中高表达。Lgr5是Wnt信号通路的靶基因,并且可以反馈性地调节Wnt信号通路的活性,从而调控细胞的生长、运动和分化。越来越多的研究证实,Lgr5可能也为结直肠癌的肿瘤干细胞标记物,可以与其他肿瘤干细胞标记物一同用于结直肠癌肿瘤干细胞的筛选。根据“肿瘤干细胞学说”,有数据表明,结直肠癌可能来源于隐窝基底部Lgr5阳性的干细胞。这就证明Lgr5可能对于结直肠癌的发生发展具有重要作用。然而,目前关于Lgr5在肿瘤形成、发展以及转移过程中的作用及其机制的研究较少。我们课题组前期证实在结直肠癌细胞中敲低Lgr5的表达后可以抑制肿瘤的血管生成。研究目的为了避免单方面敲低Lgr5表达引起实验结果的偶然性以及进一步探讨Lgr5在结直肠癌及其转移癌中的作用,Lgr5对VEGF的影响及其机制,为以Lgr5为靶点的结直肠癌治疗提供理论依据。研究方法1.构建Lgr5过表达质粒并建立稳定细胞株根据完整的人Lgr5（NM₀03667）基因序列信息设计其编码区扩增引物,引物序列见表一,引物扩增总长度为2745bps。将其克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,经检测序列正确。利用Lipofectamine2000将pcDNA3.1（+）-Lgr5质粒、pcDNA3.1（+）空载体质粒瞬时转染入SW480细胞,48小时后,以1000ug/mlG418进行连续筛选,约2-3周挑克隆并扩大培养,以600ug/mlG418继续维持。2. Western blotting提取细胞的总蛋白,用BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度,蛋白质样品上样量为20μg。电泳后将蛋白质电转至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭,4℃孵育一抗过夜,一抗稀释比例为（Lgr51:500, VEGF1:200, GAPDH1:1000,β-actin1：1000）,次日二抗孵育1小时,ECL化学发光法显影。3.实时荧光定量PCR （qRT-PCR）提取细胞、组织总RNA并测定RNA浓度,用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链,使用Takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR,引物序列见表一。4.免疫组织化学（SP法）收集南方医院结直肠原发癌标本58例,结直肠癌转移癌标本8例,组织经10%福尔马林固定,石蜡包埋,标本切成4μm薄片,65℃烤箱烤片约3小时,依次脱蜡水化,以0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）高温微波修复15mmin,利用迈新公司UltraSensitiveS-P超敏试剂盒,一抗4℃冰箱孵育过夜（Lgr51:50、CD311:50）,经DAB显色剂显色,苏木素复染,脱水透明,封片风干,显微镜下观察并拍片,两个病理科医生分别独立阅片并评分。5.HE染色组织经10%福尔马林固定,石蜡包埋,标本切成4μ.m薄片,65℃烤箱烤片约30分钟,依次脱蜡水化,苏木素染色2-5分钟,1%盐酸酒精分化,流水冲洗返蓝15分钟,伊红染色数秒至数分钟,脱水透明,封片晾干,显微镜下观察并拍片。6. Transwell小室迁移与侵袭实验将100u1浓度为以1x106/ml的细胞悬液加于上室,然后将500u1含10%FBS的培养基加于下室,培养24小时后,取出小室,4%多聚甲醛将细胞固定30分钟,结晶紫中染色10分钟,用棉签擦掉上室残留细胞,显微镜下随机选取5个视野进行细胞计数。侵袭实验在上室铺有一层基质胶,其余方法及操作均同迁移实验。7.小管形成实验质粒瞬时转染后48小时收集培养基,经孔径为0.22μmn的滤器分别过滤,收集为条件培养基。基质胶加入96孔板中,每孔加入50ul,37℃温度下交联1小时使胶固化。每孔加入50u1浓度为2×105/ml的HMVEC细胞,并且加入相应的条件培养基。于0h、2h、4h、8h在倒置显微镜下观察HMVEC细胞形成小管样结构的情况,并拍照,计数视野中小管样网状结构中的闭合环形小管结构的个数。8. Elisa实验根据人血管内皮生长因子（VEGF） Elisa试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）的操作说明,检测重组细胞培养基中VEGF的浓度。9. AOM/DSS模型的建立选取5-6周balb/c小鼠,随机分成2组,每组10只。实验组用终浓度为1.25mg/ml的AOM按照12.5mg/kg的剂量腹腔注射一次（10ul/g）,对照组以腹腔注射等剂量生理盐水。对照组不做特殊处理,实验组进行如下处理：第1周正常饮水；第2周饮水含2.5%DSS,第3、4周连续2周正常饮水,此为一个循环；第5-10周,重复第2、3、4周处理2次,即总共三个循环。继续饲养至17周,处死老鼠并取结肠组织,观察其瘤体情况,将结肠以10%福尔马林固定,石蜡包埋,行HE染色。提取结肠组织RNA,并进一步行实时荧光定量PCR检测Lgr5以及VEGF的表达量。10.裸鼠成瘤与肝转移实验裸鼠成瘤实验选取5-6周Balb/c裸鼠,随机分成2组,每组7只,饲养等级为SPF级。分别注射SW620Lgr5shRNA细胞、SW620NC细胞至裸鼠背侧,调整细胞浓度为1×107/ml,注射200ul,注射细胞数为2×106个。观察裸鼠的成瘤情况,每隔3天称量裸鼠的体重,测量肿瘤的长径（L）以及宽径（W）,以公式L×w2/2计算出瘤体的体积。4周后,裸鼠安乐死,并取下瘤体,经10%福尔马林固定石蜡包埋,供后续HE染色。裸鼠结直肠癌肝转移实验前期细胞准备与裸鼠同成瘤实验,以1%戊巴比妥钠6-8ul/g腹腔注射麻醉裸鼠,在裸鼠左侧背部取长约1cm小口,暴露脾脏,沿着脾门上缘从脾脏头侧进针向脾脏尾部注射,将100ul浓度为1×107/ml的细胞缓慢注入脾被膜下,注射成功后,清理腹腔,逐层关腹并逐层缝合,并以纱布包扎。观察裸鼠的生长状态,每隔3天称量裸鼠的体重。3周后,处死裸鼠,并取下脾脏、肝脏、肺脏等组织,经10%福尔马林固定石蜡包埋,供后续HE染色。结果1.免疫组化初步结果显示,在结直肠原发癌以及转移癌中,存在Lgr5表达越高,微血管密度（MVD）越高的趋势对结直肠原发癌、淋巴结转移癌、肝转移癌组织标本进行免疫组织化学染色,检测Lgr5以及血管内皮标记物CD31的表达,发现Lgr5的表达在淋巴结转移癌与肝转移癌中表达更高,并且CD31的表达同样也升高,即微血管密度升高。免疫组化初步结果显示,在结直肠原发癌以及转移癌中,存在Lgr5表达越高,微血管密度（MVD）越高的趋势,然而这种趋势以及二者的相关性还需要通过进一步加大样本量,获得统计学数据加以证明。2.成功构建高表达Lgr5的稳定细胞株转染Lgr5重组过表达质粒pcDNA3.1（+）-Lgr5及pcDNA3.1（+）空载体质粒进入SW480并采用G418进行筛选,分别采用western blotting与实时荧光定量PCR技术检测Lgr5在SW480Lgr5与SW480vector中蛋白质以及mRNA的表达水平。结果发现,与SW480vector相比,Lgr5的蛋白质表达水平在SW480Lgr5细胞中明显升高；Lgr5的mRNA表达水平在SW480Lgr5细胞中同样明显升高（t=-17.499,p<0.05）。3.Lgr5对肿瘤细胞迁移与侵袭能力的影响在迁移与侵袭实验中,与SW480vector细胞组相比,SW480Lgr5细胞组迁移与侵袭的细胞数明显增多（迁移：t=4.291,p<0.05；侵袭：t=3.127,p<0.05）；与SW620NC细胞组相比,SW620Lgr5shRNA细胞组迁移与侵袭的细胞数明显减少（迁移：t=6.557,p<0.01；侵袭：t=2.297, p<0.05）。Transwell小室迁移与侵袭实验表明,升高Lgr5表达后肿瘤细胞的迁移与侵袭能力明显增强,敲除Lgr5表达后肿瘤细胞的迁移与侵袭能力明显减弱。4.Lgr5对内皮细胞小管形成能力的影响用内皮细胞在Matrigel中形成闭合环形小管的数目表示内皮细胞小管形成的能力。与SW480vector组相比,SW480Lgr5组小管样结构明显增多（t=8.617,p<0.05）；与SW620NC组相比,SW620Lgr5shRNA组小管样结构数明显减少（t=5.670,p<0.05）。5.Lgr5对结直肠癌细胞内血管内皮生长因子的影响通过Western blotting发现,与SW480vector细胞相比,SW480Lgr5细胞中VEGF的蛋白含量明显增多,与SW620NC细胞相比,SW620Lgr5shRNA细胞VEGF的蛋白含量明显减少。通过Elisa发现,与SW480vector组相比,SW480Lgr5组中分泌VEGF的量明显增多（t=12.58,p<0.01）,与SW620NC组相比,SW620Lgr5shRNA组分泌VEGF的蛋白含量明显减少（t=8.104,p<0.01）。6. AOM/DSS模型中,肿瘤组织Lgr5与VEGF的mRNA表达明显增高成功建立AOM/DSS模型,提取建模成功后的小鼠结肠组织RNA,行qRT-PCR显示,与对照组相比,实验组中Lgr5以及VEGF的mRNA的表达量明显升高（Lgr5:t=14.30, p<0.01; VEGF:t=9.213, p<0.01）。7.敲低Lgr5的表达后,降低结直肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤以及肝转移能力在成瘤实验中,NC组的瘤体体积明显大于Lgr5shRNA组,并且这种显著差异在第3周开始体现出来。在裸鼠结肠癌肝转移实验中,与NC组相比,Lgr5shRNA组肝脏内癌结节数目明显较少（t=-4.386,p<0.05）。结论通过以上实验结果,我们可以得出以下结论：1.在体外,Lgr5可以促进结直肠癌细胞的迁移与侵袭能力；2.在体内,Lgr5可以促进结直肠癌的成瘤以及肝转移；3.Lgr5可以促进内皮细胞的血管生成,可以促进结直肠癌中VEGF的表达；我们通过功能性获得与失去实验、体内外实验,发现在结直肠癌中,Lgr5可能是通过促进VEGF的表达,从而促进血管生成,最终促进肿瘤形成与转移。因而我们的研究可以为以Lgr5为靶点的治疗策略提供理论依据。