miRNA-20/106通过抑制TIMP-2表达促进人胶质瘤干细胞侵袭的机制研究

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背景和目的:恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性脑肿瘤。肿瘤细胞的侵袭性生长是恶性胶质瘤的重要生物学特性,这种侵袭特性使得手术难以彻底切除肿瘤组织,而且化疗和放疗效果差,术后复发率高,预后不佳。恶性胶质瘤的侵袭性生长和治疗抵抗机制尚不清楚。最近大量的研究表明,肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在肿瘤发生与发展中发挥重要作用。来自其他研究者和我们的研究发现恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs),这些GSCs具有自我更新、多向分化潜能以及形成肿瘤的能力。同时发现,GSCs具有高侵袭力,然而具体的分子机制不明。microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度约为21~23个核苷酸的非编码单链小分子RNA,它们通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’UTR)相互作用导致靶mRNA降解或抑制蛋白质的合成,在肿瘤细胞癌基因和抑癌基因的调控中发挥重要作用。miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平明显异常,这种表达异常与肿瘤细胞包括胶质瘤细胞(glioma cells,GCs)的增殖、凋亡、侵袭转移以及血管生成等方面密切相关。miR-20a和miR-106a分别属于miR-17-92家族和它的旁系miR-106a-363家族。miR-20/106广泛表达于不同的细胞类型中。目前有研究显示miR-20/106具有癌基因或抑癌基因的作用。然而,miR-20/106在GSCs侵袭中的作用目前仍不十分清楚。金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)通路在肿瘤的侵袭中具有重要的作用。几乎所有类型的ECM都可以被MMP2和MMP9降解,因为它们对ECM的成分具有特异的酶活性。MMP2和MMP9的活化与肿瘤的侵袭和不良的预后相关。已往的研究进一步证明了降低MMP2和MMP9的表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭。TIMP-2是MMP2和MMP9的天然抑制物。TIMP-2在许多肿瘤包括胶质瘤中表达都是降低的,但其中的原因尚不明确。通过计算机预测和生物信息学分析,我们发现TIMP-2可能是miR-20/106的潜在靶基因之一。因此,我们推测,miR-20/106可能是通过抑制TIMP-2的表达促进了GSCs的侵袭。本研究中,我们首先分离并鉴定了人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的CD133~+胶质瘤细胞,鉴定了这些细胞具有GSCs特性;然后,我们检测了miR-20/106和TIMP-2通路在胶质瘤细胞和GSCs中的表达;最后,我们研究了miR-20/106对TIMP-2的直接调控作用并证明这是miR-20/106促进GSCs侵袭的重要机制。材料和方法:1.采用流式细胞分选技术(FACS)从人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本中分离出CD133~+胶质瘤细胞。2.从神经细胞球形成、神经干细胞标记物免疫荧光染色、多向分化潜能和体内成瘤能力四个方面鉴定分选出的GSCs。3.采用microRNA芯片和实时定量PCR(qRT–PCR)技术检测miR-20/106在GSCs和GCs中的表达。4.采用qRT–PCR和蛋白免疫印迹杂交(western blot)技术检测TIMP-2和其下游靶基因MMP2、MMP9在GSCs和GCs中的表达。5.采用Transwell体外侵袭实验检测GSCs和GCs的侵袭能力。6.采用Transwell体外侵袭实验检测miR-20/106对GSCs侵袭的影响。7.采用qRT–PCR和western blot技术检测转染了miR-20/106抑制剂的GSCs中TIMP-2、MMP2和MMP9表达的变化。8.采用荧光素酶报告基因实验检测miR-20/106对TIMP-2的直接调控作用。结果:1.成功分离和鉴定出人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的GSCs。流式细胞技术检测分选前,CD133~+细胞占胶质瘤细胞系U87以及原代胶质瘤细胞1、2的比例分别为0.5%、2.4%和1.5%。分选后回测,CD133~+细胞比例高达95%以上,CD133-细胞中CD133的表达在1%以下。分选出的CD133~+细胞具有形成神经细胞球的能力。免疫荧光染色显示,分选出的CD133~+细胞广泛表达神经干细胞标记物CD133和nestin。多向分化潜能实验采用免疫荧光染色方法显示,CD133~+细胞球经诱导后能分化成表达GFAP、β-tubulin III和MBP的分化细胞。体内成瘤实验显示,CD133~+细胞成瘤能力显著高于CD133-细胞。这些结果显示,我们分选出的CD133~+细胞具有干细胞样特性即是GSC。2.GSCs高表达miR-20/106、低表达TIMP-2。miR-20/106在GSCs中的表达显著高于GCs(P<0.05),和microRNA芯片结果相符合。TIMP-2无论mRNA水平还是蛋白水平在GSCs中的表达显著低于GCs(P<0.05),而MMP2、MMP9的mRNA水平和蛋白水平在GSCs中的表达显著高于GCs(P<0.05)。3.miR-20/106对GSCs侵袭能力的促进作用。GSCs的侵袭能力显著高于CD133- GCs(P<0.05)。转染了miR-20/106抑制剂后, GSCs的侵袭能力显著下降(P<0.05)。4.miRNA-20/106对TIMP-2表达的下调作用。转染了miR-20/106抑制剂的GSCs中,TIMP-2的mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高(P<0.05),而MMP2、MMP9的mRNA水平和蛋白水平则显著下降(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验显示,转染了miR-20/106抑制剂后,含有野生型TIMP-2 3’UTR的报告质粒荧光素酶活性显著增加(P<0.05),转染miR-20/106的模拟体后,报告质粒荧光素酶活性则显著降低(P<0.05)。而miR-20/106的抑制剂和模拟体对含有突变型TIMP-2 3’UTR的报告质粒的荧光素酶活性无显著影响(P>0.05)。结论:本研究采用流式分选术从人胶质母细胞瘤细胞系U87和人脑原发性胶质母细胞瘤标本中分离、鉴定出胶质瘤干细胞(GSCs),证明GSCs具有高侵袭特性,发现miR-20/106高表达促进了GSCs的侵袭性,其机制至少是通过下调TIMP-2、上调MMP2和MMP9表达而实现的。本研究首次揭示了miR-20/106在胶质瘤干细胞侵袭特性中的重要作用,为认识恶性胶质瘤的侵袭性生长机制,探讨新的阻遏策略提供新的证据。
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