论文部分内容阅读
目的:分别检测成人、婴儿和低龄狒狒RBCs和PBMCs表面Gal,Neu5Gc和Sda抗原及其血清中相关抗体的表达,以及心脏手术对婴儿体内相关抗体的影响,探讨低龄狒狒作为TKO猪-婴儿异种心脏移植实验模型的可能性,并为转基因猪心脏移植给婴儿提供实验依据。材料与方法:材料:40份健康成人血清来自美国自愿捐献者;84份术前先心病患儿(非暴露组)及25份术后先心病患儿(暴露组)血清由阿拉巴马大学伯明翰分校儿科医院提供;40份狒狒的血清及不同基因型猪全血由美国Revivicor公司提供。方法:(1)FCM检测Gal、Neu5Gc、Sda抗原在人类、狒狒及不同基因型猪RBCs、PBMCs上的表达;(2)FCM检测成人、非暴露组婴儿及低龄狒狒血清IgM和IgG与WT、TKO猪RBCs的结合;(3)FCM检测成人、非暴露组婴儿血清IgM和IgG与TKO猪CD3+T细胞(来自血PBMC)结合:(4)FCM检测非暴露组和暴露组婴儿血清IgM和IgG与WT、TKO猪RBCs以及CD3+T细胞的结合;(5)FCM检测WT、TKO PBMC与成人和婴儿(包括非暴露组和暴露组)CDC。结果:(1)FCM检测Gal、Neu5Gc、Sda抗原在人类、狒狒及转基因猪RBCs、PBMCs上的表达:(1)人类在RBCs和PBMCs上不表达Gal,Neu5Gc和Sda抗原;(2)狒狒在RBCs和PBMCs上表达Neu5Gc,不表达Gal和Sda抗原;(3)WT猪表达Gal、Neu5Gc和Sda三种抗原;敲除Gal、Neu5Gc和Sda三基因的TKO猪相应抗原不表达。(2)FCM检测成人、非暴露组婴儿及低龄狒狒血清IgM和IgG与WT、TKO猪RBCs结合:(1)非暴露组婴儿:IgM与WT RBCs53%呈阳性,IgG78%呈阳性;IgM与TKO RBCs呈阴性,IgG与TKO RBCs 1%呈弱阳性;(2)成人组:IgM/IgG与WT RBCs100%阳性;IgM与TKO RBCs 5%阳性、IgG呈阴性;(3)低龄狒狒组:IgM和IgG与WT RBCs100%呈阳性;IgM与TKO RBCs 95%呈阳性,IgG 45%呈阳性;(3)FCM检测成人、非暴露组婴儿IgM和IgG与TKO猪CD3+T细胞结合:成人组(IgM:1.031±0.06;IgG:0.89±0.12)和婴儿组(IgM:1.096±0.05;IgG:1.096±0.05)IgM和IgG的结合没有显著性差异(p>0.05),并且与阴性对照组(IgM:1.094±0.07;IgG:0.89±0.03)没有显著性差异(p>0.05)(除了成人血清IgM稍低于阴性对照(p<0.05))。(4)FCM检测非暴露组婴儿及暴露组婴儿血清IgM和IgG与WT、TKO猪RBCs和CD3+T细胞结合:(1)与WT RBCs,非暴露组:50%IgM阳性,76%IgG阳性。暴露组:100%IgM阳性,96%IgG阳性。暴露组IgM和IgG的结合显著性高于非暴露组(p<0.05);(2)TKO RBCs:非暴露组:0%IgM阳性,2%IgG阳性。暴露组:4%IgM阳性,4%IgG阳性。尽管暴露组IgM结合显著高于非暴露组(p<0.05),但仅有一份暴露组血清呈弱阳性;IgG结合在两组之间没有显著性差异(p>0.05);(3)与TKO CD3+T细胞结合,非暴露组:22%IgM阳性,58%IgG阳性。暴露组:11%IgM阳性,8%IgG阳性。暴露组和非暴露组IgM和IgG没有显著差别(p>0.05)。(5)WT和TKO PBMCs与成人及婴儿血清共孵育,加入兔补体,分别测量成人、婴儿血清CDC:(1)WT猪PBMC中,成人血清细胞毒反应(100%阳性)显著高于非暴露组婴儿(50%阳性)(p<0.05)及阴性对照组(p<0.05)。然而在TKO猪PBMC中,成人血清细胞毒反应(15%阳性)明显降低,稍低于阴性对照组(p<0.05);婴儿非暴露组血清的细胞毒反应(40%阳性)与成人及阴性对照组均没有显著差异(p>0.05)。(2)与WT猪PBMC结合,暴露组血清的细胞毒反应(100%阳性)显著高于非暴露组(67%阳性)(p<0.05),然而在TKO PBMC中,暴露组血清(64%阳性)与非暴露组血清的细胞毒反应(40%阳性)没有显著差异(p>0.05)。结论:(1)人类不表达Gal,Neu5Gc和Sda抗原,但存在相应抗体,婴儿抗体水平较低;低龄狒狒表达Neu5Gc,不表达Gal和Sda抗原,存在Gal和Sda抗体,水平较高;WT猪表达Gal、Neu5Gc和Sda三种抗原;敲除Gal、Neu5Gc和Sda三基因的TKO猪不表达相应抗原。(2)移植前的心脏手术不会升高婴儿体内的抗Gal/Neu5Gc/Sda(抗TKO)抗体水平;由于预先形成的抗TKO抗体水平低,TKO猪器官/组织/细胞移植给婴儿可能是可行的。(3)低龄狒狒体内抗Gal/Neu5Gc/Sda(抗TKO)抗体的水平显著高于婴儿,因此,不适合作为猪-婴儿异种心脏移植模型受体。