研究背景及目的黄褐斑（melasma）是一种十分常见的色素异常沉着性疾病,易诊难治。好发于Fitzpatrick皮肤分型中Ⅳ至Ⅵ型的个体,亚洲和非洲裔女性尤其易受累。目前临床上常采用激光、药物、微针等联合治疗,但个体疗效差异大且治疗后易复发。黑素是决定皮肤颜色最主要的色素,由黑素细胞（melanocytes,MCs）中的黑素小体经过一系列复杂而精细的酶促生化反应合成并储存。黑素小体是黑素合成与储存的场所,它是MCs中一种单层质膜包裹的溶酶体样细胞器,最初来源于内质网产生的一种相对无定形的球状囊泡,其腔内环境的p H值约为4～5。酪氨酸酶（tyrosinase,TYR,EC 1.14.18.1）作为黑素合成的关键酶,其发挥活性的最适p H值是6.8,催化黑素合成早期的限速反应,当黑素小体腔内p H＜5.5时,TYR几乎完全处于失活状态。维生素C（vitamin C,L-ascorbic acid,VC）,即L-抗坏血酸,已有众多临床研究证实VC及其衍生物对面部黄褐斑等色素沉着疾病具有治疗作用,我们推测VC及其衍生物是否通过影响黑素小体腔内p H值抑制表皮黑素生成。目前市场上的皮肤脱色剂多通过抑制TYR的活性从而减少黑素生成,但有报道指出,化妆品及防晒品中过度添加酪氨酸酶抑制型皮肤脱色剂,可增加紫外线照射诱导的光致癌风险,这是由于削弱了黑素吸收并抵挡紫外线照射的功能,导致角质形成细胞基因突变和氧化应激损伤。此外,黑素小体超微结构的完整性对角质形成细胞的光保护作用同样关键,降解（或破碎）的黑素小体在紫外线照射下,产生大量活性氧基团（reactive oxygen species,ROS）,削弱皮肤的光保护作用。氢醌（1,4-对苯二酚）（hydroquinone,HQ）是一种代表性的酪氨酸酶抑制型皮肤脱色剂,是目前公认的治疗黄褐斑的有效药物之一,但其制剂不稳定易变色,且长期高浓度使用可导致外源性褐黄病、永久性色素脱失,动物实验表明HQ具有致癌性,可引起小鼠肝肾肿瘤及白血病。美国食品和药品管理局2006年明确提出禁止HQ作为非处方药售卖。因此,亟待探寻新一代高效安全的皮肤增白成分从而替代HQ。熊果苷（arbutin,Arb）是一种天然来源的对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,脱氧熊果苷（deoxy-arbutin,D-Arb）为Arb的葡萄糖侧链去羟基衍生而成。二者为HQ的葡萄糖苷衍生物,化学性质稳定且毒副作用低。我们比较了HQ、Arb和D-Arb对黑素小体超微结构的影响,以期阐述其发挥皮肤脱色作用时的生物安全性问题。本课题研究内容分为三个部分:1、研究VC、抗坏血酸磷酸酯镁（magnesium ascorbyl phosphate,MAP）和抗坏血酸乙基醚（3-o-ethyl-L-ascorbic acid,AAE）是否可通过调节黑素小体及溶酶体相关细胞器（lysosome-related organelles）p H值抑制黑素合成,测定钠依赖性维生素C转运蛋白（SVCT）在MCs的表达及VC的抗氧化作用。2、使用308 nm准分子光诱导棕黄色豚鼠色素沉着动物模型,Fontana-Masson染色观察HQ、Arb和D-Arb对皮肤的脱色作用及表皮内黑素颗粒的分布,透射电子显微镜（TEM）观察黑素小体超微结构的改变。3、研究木质素过氧化物酶（Li P）、锰过氧化物酶（Mn P）和漆酶（Laccase）对皮肤及毛发提取黑素的脱色可能性,并选取脱色效果最佳的Li P酶液外擦于豚鼠色素沉着动物模型,观察其体内脱色效果。研究方法与结果1.CCK-8法检测不同浓度VC、MAP和AAE（0.1,0.3,1,3,10 mmol/L）处理MCs后的细胞增殖率,确定各种化合物的最佳药物使用浓度。氢氧化钠裂解法检测2μmol/Lα-MSH,3μmol/L HQ,1 mmol/L VC,1 mmol/L MAP和1 mmol/L AAE处理48小时后黑素含量的改变。Dot-blot检测各处理组TYR活性的改变,Western-blot检测黑素合成相关蛋白TYR、Pmel17（pre-melanosome protein 17,Pmel17）和小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor,MITF）的表达水平。结果表明VC、MAP和AAE可不同程度抑制黑素合成,这与其抑制TYR活性相关,但并不影响TYR、Pmel17和MITF的蛋白表达水平。此外,使用吖啶橙（acridine orange,AO）和溶酶体荧光探针Lyso Sensor Green DND-189染色,观察了VC及其衍生物处理后MCs内黑素小体等溶酶体相关细胞器的p H值改变,结果表明VC及其衍生物可酸化黑素细胞内溶酶体、黑素小体等相关细胞器,而且,V型H+-ATP酶抑制剂刀豆素A（concanamycin A,Con A）和亲溶酶体弱碱氯化铵（NH4Cl）可消除这种酸化作用并恢复TYR的活性和黑素的重新合成,且与TYR、Pmel17和MITF的蛋白表达不相关。通过二氯荧光素（DCFH-DA）标记法检测MCs使用1 mmol/L VC及3 J/cm~2 UVA单独及联合处理后胞内的ROS水平,结果表明VC可显著抑制UVA诱导的黑素细胞内ROS水平的升高。Western-blot和q RT-PCR检测MCs SVCT的表达,结果表明MCs主要表达SVCT-2,使用SVCT抑制剂根皮素抑制该转运通道后,VC对MCs的酸化作用明显减弱。由于根皮素可非特异性抑制所有SVCT,因此,使用SVCT-2si RNA转染MCs,Western-blot和q RT-PCR检测到SVCT-2表达明显下降,且VC对MCs酸化作用减弱。2.使用308 nm准分子光（500m J/cm~2,隔天一次,共四次）诱导棕黄色豚鼠背部色素沉着动物模型,实验分为6组:未照光假处理组、基质组、3%过氧化氢组、5%HQ组、10%Arb组和10%D-Arb组,外用以上药物于豚鼠背部相对应的色素沉着斑10天,使用CR-10分光比色仪测量各组在用药前和用药10天后局部皮肤的L*值。结果显示5%HQ、10%Arb和10%D-Arb可显著消退UVB照射诱导的色沉斑。采用Fontana-Masson嗜银染色法观察各药物处理组前后表皮黑素分布情况和脱落角质层细胞内黑素尘颗粒分布,并通过Image-J图像分析软件计算灰度值做定量统计,结果发现5%HQ组,表皮基底层和棘层黑素颗粒明显减少,表皮厚度明显增加。10%Arb和10%D-Arb也可明显减少表皮内黑素颗粒的含量,但对表皮厚度无明显影响。采用透射电子显微镜技术（TEM）检测各药物处理组前后表皮细胞内黑素小体超微结构的变化,结果显示5%HQ组表皮内黑素小体外膜结构紊乱,可见空泡样结构,10%Arb和10%D-Arb组,黑素小体外膜超微结构无明显损伤。3.碱溶法从人毛发及皮肤黑素瘤组织中提取褐黑素并商业购买优黑素,将等量（0.02%）黑素与相同活性单位（0.2U/ml）的Li P、Mn P和漆酶孵育3h,使用酶标仪测定反应液A475值变化,结果显示3种木质素降解酶对优黑素及褐黑素均具体一定的脱色活性,其中Li P脱色效率为40%～70%,Mn P约为22%～42%,漆酶约为9%～21%。用308 nm准分子光诱导豚鼠皮肤色沉斑模型,将Li P与加热灭活Li P反应液外涂于色沉斑处,同时用3%HQ与乳膏基质作对照,发现Li P反应液与3%HQ均可使色沉斑颜色变浅。使用CR-10分光比色仪测定L*值变化,胶带法采集脱落角质层细胞,Fontana-Masson嗜银染色观察其中黑素颗粒的分布与数量,Image-J图像分析软件计算脱落角质层细胞中黑素颗粒的平均数量。结果显示Li P组为199.1±11.1,低于空白组（922.6±12.2）和Li P热灭活假处理组（988.7±13.2）。组织学检查发现HQ组表皮增厚,全层黑素颗粒减少,而Li P组表皮正常,仅表皮浅层黑素颗粒减少,基底层仍有较多黑素颗粒存在。研究结论1.VC及其衍生物通过SVCT-2进入MCs,通过酸化胞内黑素小体等溶酶体相关细胞器可逆性抑制TYR活性发挥皮肤增白作用。2.HQ可破坏黑素小体超微结构,而Arb和D-Arb在发挥皮肤脱色的同时,几乎不影响黑素小体超微结构完整性。3.Li P对皮肤与毛发提取黑素均有较强脱色活性。体内实验显示Li P发挥皮肤脱色效果时仅作用于表皮浅层,不干扰表皮基底层MCs的黑素合成。