研究背景和目的创面愈合是非常复杂且动态变化的过程,它受到多种局部和系统因素的影响,如低温、疼痛、感染、辐射、组织供氧不足、健康或疾病状态、年龄和营养不良等。其中,感染是导致不同类型创面愈合延迟的最常见的因素之一。细菌纤维素是一类天然的细胞外多糖。其具有优越的物理化学性质,包括高结晶度和纯度,更好的机械性能、持水性、组织相容性、透气性、可降解性、可塑性和组织相容性等。因此,细菌纤维素是一种较为理想的敷料材料。尽管细菌纤维素具有理想敷料的主要特征,但是其本身并无抗菌性能,这一性质限制了细菌纤维素作为医用敷料用于某些具有高感染风险创面,如大面积深度烧伤创面、慢性创面、糖尿病足创面等。通过对材料附加某些抗菌成份是赋予材料抗菌性能或活性的主要方法和思路。研究表明,金属纳米颗粒,如纳米Ag或纳米Zn O,由于其具有高的比表面积,在抗菌活性方面较普通Ag离子或Zn O具有更独特的优势,因而较广泛应用于抗菌医用敷料的制备。然而,需要指出的是,最近越来越多的研究表明,由于纳米颗粒更容易被细胞吞噬,因而易在细胞内聚集,通过不同的机制,产生真核细胞毒性。目前,已经报道的合成纳米Zn O/BCM复合敷料的几种方法,如共沉淀法、化学吸附法和原位合成法等。这些制备nZn O/BCM复合敷料方法的共性问题即是无良好的n ZnO结合稳定性,使得上述报道的nZn O/BCM复合膜存在潜在的细胞毒性和生物安全性。因此,到目前为止,尚无相关产品作为医用敷料被FDA和CFDA批准用于临床治疗。在本研究中,我们采用了不同于以往研究制备nZn O/BCM的方法。为提高nZn O与BCM的结合稳定性,本研究先对BCM进行改性,即:在BCM的侧链上引入羧基,引入的羧基再与n Zn O结合可使n ZnO的结合稳定性提高5倍。采用该新方法,本研究首次成功制备了具有n ZnO高结合稳定的nZnO/BCM复合膜。在此基础上,我们筛选出既具有良好抗菌性能又具有良好生物安全性的最适nZn O负载等级的nZn O/BCM复合膜,并通过动物实验,进一步验证最适n ZnO负载等级的nZn O/BCM对感染创面的生物学效应。方法1.n Zn O/BCM复合膜的制备及物理性质表征1.1采用二步法合成n Zn O/BCM复合膜。第一步,BCM的化学改性:用5.0%Li Cl溶胀BCM8-12h,将溶胀处理后的BCM与顺丁烯二酸酐反应,对BCM进行化学改性,即:在其侧链基团引入羧基,并对其进行傅里叶红外检测,验证化学改性是否成功;第二步,n Zn O的原位合成:以化学改性后的BCM为模板,通过水合法原位合成n Zn O/BCM,并对n ZnO与细菌纤维素的结合稳定性进行检测。1.2 nZn O/BCM复合膜的形貌观察通过扫描电镜对比观察BCM和n ZnO/BCM的形貌、孔隙结构以及nZn O颗粒大小、形态和分布;1.3 nZn O/BCM复合膜的物理性质表征通过动态机械分析仪检测n Zn O/BCM的力学性能;采用WVTR法检测nZn O/BCM的透气性。2.最适n ZnO负载等级的nZnO/BCM复合膜的筛选及生物安全性评价2.1不同n Zn O含量的nZnO/BCM复合膜的抗菌性能评价采用振荡烧瓶法对35wt.%,25wt.%,15wt.%和5wt.%四种不同n Zn O/BCM的抗菌性能进行评价。2.2不同nZn O含量的n Zn O/BCM复合膜的细胞毒性检测根据《ISO 10993-5:2009医疗器械生物学评价_第5部分_体外细胞毒性试验》中规定的方法对上述四种不同n Zn O含量的n ZnO/BCM进行细胞毒性检测。综合对比不同n Zn O含量的n ZnO/BCM的细胞毒性和抗菌性能,筛选出既具有抗菌活性,又无体外细胞毒性的最适nZn O负载等级的n Zn O/BCM。2.3皮肤刺激性检测按照《IS0 10993-10医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验》要求对筛选出的最适n Zn O负载等级的nZn O/BCM复合膜的皮肤刺激性进行检测。2.4组织相容性评价通过小鼠皮下植入后局部反应实验对筛选出的最适nZnO负载等级的n Zn O/BCM复合膜的组织相容性进行评价。3.最适n ZnO负载等级的nZnO/BCM促进感染创面愈合的作用评价通过建立金葡菌和大肠杆菌双重感染创面小鼠模型,将纱布、BCM和筛选出的n Zn O/BCM复合膜应用于小鼠创面,观察小鼠创面的炎症反应情况,大体愈合情况,创面收缩情况;对创面组织匀浆后细菌定量;制备病理切片,通过苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色,利用Image pro plus 6.0(IPP 6.0)软件测量不同处理组的新生上皮长度,对创面炎症细胞计数。结果1.nZn O/BCM的原位合成和物理性质表征1.1通过化学改性在BCM分子上成功引入了含有羧基的侧链基团,以化学改性后的BCM为模板,采用水合法原位合成了nZn O。1.2 nZn O/BCM复合膜中n ZnO的脱失率为8.98%。1.3经检测,nZn O/BCM复合膜的力学性能优异(抗张强度:29.68MPa、杨氏模量:2387.41 MPa、断裂伸长率1.30%),同时具有合适的水蒸气透过率(transmission rate,WVTR,2856.60 g/m2·day),适宜应用于创面。2.最适n ZnO负载等级的n Zn O/BCM复合膜的筛选和生物安全性评价2.1通过振荡烧瓶法评价nZnO/BCM复合膜抗菌性能发现,35wt.%、25wt.%、15wt.%、5wt.%四种不同nZn O含量的nZn O/BCM复合膜对金葡菌的抑菌率分别为100.00%、99.98%、99.48%、96.73%;对大肠杆菌抑菌率分别为99.50%、97.33%、93.10%、60.33%。2.2通过体外细胞毒性检测发现,上述四种不同n ZnO含量的nZn O/BCM复合膜的浸提液培养的L929细胞的相对增值率分别为4.43%、3.60%、0.90%、109.08%。所以5wt.%n Zn O/BCM复合膜既具有抗菌性能,又无细胞毒性,所以我们选择5wt.%n ZnO/BCM复合膜进行进一步的在体生物安全性评价。2.3以白化兔为动物模型的皮肤刺激性检测发现5wt.%nZn O/BCM无皮肤刺激性;小鼠皮下植入后局部反应实验表明,5wt.%n ZnO/BCM复合膜在植入后1周、3周、9周,其周围的炎细胞浸润和纤维囊厚度与BCM无差异,具有非常良好的组织相容性。3.5wt.%nZnO/BCM复合膜促进感染创面愈合的作用评价以金葡菌和大肠杆菌双重感染小鼠创面为动物模型,通过对创面组织细菌定量分析发现,5wt.%nZn O/BCM复合膜能抑制局部细菌增殖;通过创面组织炎性细胞浸润定量分析和创面愈合情况观察发现,5wt.%n Zn O/BCM复合膜能有效控制创面炎症反应,减少炎性细胞浸润,同时,显著加快感染创面的再上皮化进程和创面愈合速度。结论1.采用创新技术成功制备了具有良好n Zn O结合稳定性的新型n ZnO/BCM复合膜;2.明确5%wt.%n ZnO/BCM复合膜既具有抗菌性能,又具有良好的生物安全性和物理特性,符合医用敷料的基本要求;3.在体证实5wt.%nZnO/BCM复合膜能抑制感染创面细菌增殖,减轻炎症反应,促进感染创面愈合的重要作用。4.研究为下一步研发用于预防和控制创面感染的nZnO/BCM医用敷料奠定了良好的理论、工艺和实践基础。