骨关节炎是关节炎中的一种,是一种常见的慢性退化性疾病,以关节软骨破坏,关节软骨基质丢失,关节滑膜炎症产生,关节软骨下骨硬化以及骨赘形成为主要特点。骨关节炎影响了世界15%的人口,然而却没有一种方法能有效的预防或治疗骨关节炎。现在市场上销售的药物多以缓解关节炎症,降低疼痛为主要治疗目的,却没有能从根本上改善或者治疗骨关节炎。在本研究中,我们探索了生长因子progranulin的衍生的工程蛋白Atsttrin在骨关节炎动物模型中的作用。首先,我们发现作为progranulin的衍生工程蛋白,Atsttrin能够缓解由于progranulin确失而引起的加重的骨关节炎。其次,在手术诱导的骨关节炎小鼠模型中,我们发现Atsttrin能有效预防关节软骨的丢失破坏。并且,Atsttrin能显著降低在骨关节炎发展过程中发生的滑膜炎。而且,Atsttrin能显著减少软骨下骨破骨细胞的生成,有效抑制软骨下骨的骨丢失,以维持软骨下骨的厚度。更重要的是,行为学检查发现局部注射Atsttrin能明显降低骨关节炎相关疼痛。更进一步,我们分离出背根神经节进行基因检测分析,发现Atsttrin在神经节中能显著降低炎症相关性的疼痛因子的基因表达。除了预防作用之外,我们发现Atsttrin在非侵入性骨关节炎大鼠模型中,Atsttrin能有效治理骨关节炎。因为Atsttrin能够和肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor Receptors,TNFRs)特异性结合,为进一步明确Atsttrin发挥作用的机制,我们在野生型小鼠,肿瘤坏死因子受体1基因敲除(Tumor Necrosis Factor Receptors 1 knockout,TNFR1-/-)鼠和肿瘤坏死因子受体2基因敲除(Tumor Necrosis Factor Receptors2 knockout,TNFR2-/-)鼠中建立了手术诱导的前交叉韧带离断性骨关节炎模型,待骨关节炎成功诱导之后,我们局部注射Atsttrin。研究发现,在野生型小鼠中,Atsttrin能有效保护关节软骨,在]NFR1基因敲除鼠中,Atsttrin仍有一部分保护作用,然而同野生型小鼠比较,保护作用相对减弱。相反的,在TNFR2基因敲出鼠中,Atsttrin介导的关节保护作用完全丧失了。因此,Atsttrin介导的保护作用依赖于TNFR1和TNFR2两条信号通路。为进一步明确在此过程中的分子机制,我们发现Atsttrin通过调节软骨代谢来发挥其作用。首先,我们发现Atsttrin具有促进合成代谢的作用。具体的说,Atsttrin能够促进软骨合成代谢的基因标志物,如二型胶原,蛋白聚糖的表达。为探索Atsttrin激活的信号通路,我们采用鸡尾酒信号通路筛选MAPK信号通路的改变,发现Atsttrin在人原代软骨细胞中,能强烈并有效激活Akt信号通路,并且,Atsttrin能轻微激活Erkl/2信号通路,与此同时,其他信号通路,如S-6,P90等没有明显变化。为进一步明确这种激活是否具有特异性,我们分别或共同应用Akt信号通路的抑制剂Wortmannin,Erk1/2信号通路的抑制剂U0126来阻断Akt,Erk1/2信号通路。研究发现,分别应用其信号抑制剂阻断Akt信号通路或Erk1/2信号通路后,Atsttrin介导的二型胶原和蛋白聚糖的表达量显著降低,当同时阻断Akt信号通路和Erkl/2信号通路后,Atsttrin介导的合成作用完全丧失了。此结果表明,Atsttrin介导的合成代谢作用依赖于Akt信号通路和Erkl/2两条信号通路。为进一步明确哪一个受体在Atsttrin介导的合成代谢中发挥作用,我们在野生型,TNFR1基因敲除鼠和TNFR2基因敲除鼠的膝关节中分离出原代的软骨细胞,待细胞贴壁后,并予以Atsttrin刺激培养。实验发现,Atsttrin介导的Akt信号通路和Erkl/2信号通路在野生型和TNFR1基因敲除鼠的软骨细胞中正常激活,而这种激活作用在TNFR2基因敲除鼠中几乎完全丧失了。更进一步的,在野生型和TNFR1基因敲除鼠的软骨细胞中,Atsttrin能显著促进二型胶原和蛋白聚糖的基因表达,而在TNFR2基因敲出鼠中,Atsttrin几乎不能促进二型胶原和蛋白聚糖的基因表达。综上所诉,Atsttrin介导的软骨合成作用依赖于TNFR2-Akt/Erk1/2信号通路。除了合成作用,Atsttrin也有效抑制TNFα介导的分解代谢。因为TNFα在骨关节炎发病过程中水平显著升高,而且TNFα处在炎症级联反应的顶端,前期研究表明,在多种动物模型中,通过阻断TNFα信号通路可以改善骨关节炎,而且有二期临床试验研究表明,TNFα抑制剂能够显著改善病人骨关节炎。考虑到Atsttrin能特异性结合到TNFRs以及TNFα在骨关节炎中发挥的作用,为进一步研究是否Atsttrin能够竞争性抑制TNFα介导的炎症性分解代谢,我们采用人原代关节软骨及软骨细胞进行研究。首先,我们分离人的原代软骨进行培养。Atsttrin能有效抑制TNFα介导的蛋白多糖的丢失。其次,我们分离软骨细胞进行培养,发现Atsttrin能显著降低由TNFα诱导产生的分解代谢标志物的表达,如金属蛋白酶MMP3, MMP13,ADAMTS-5以及炎症标志物NOS-2。为进一步了解其机制,我们将人的原代软骨细胞进行不同培养之后,提取RNA,进行基因水平检测,发现Atsttrin有效抑制TNFα诱导产生的前炎症性因子的表达。除此之外,众所周知,TNFα在软骨细胞中能激活MAPK及NF-KB信号通路,从而进一步激活各种下游炎性转录因子的表达,导致关节软骨破坏。在本实验中,Atsttrin能够有效抑制TNFα介导的MAKP及NF-KB信号通路的激活,从而使炎症性分解代谢标志物如金属蛋白酶MMP3,MMP13以及ADAMTS-5的表达明显降低,同时炎症标志物NOS-2的表达也明显降低。TNFα/NF-KB是经典的代谢通路。NF-KB有两个亚基组成,分别为p50(IKB)和p65组成。在细胞未受刺激情况下,p50与p65在细胞核内相互结合形成稳定的复合物。细胞一旦受到TNFα刺激,NF-KB信号通路被激活。IKB磷酸化,释放p65,磷酸化的p65转移到细胞质内,从而激活一系列下游炎症性转录因子。本课题研究发现在人的原代软骨细胞中,Atsttrin能强烈有效抑制NF-KB的磷酸化。而且,在动物骨关节炎模型的关节软骨中发现,Atsttrin能有效抑制IKB的磷酸化。同时,我们分别提取细胞质和细胞核中的蛋白,并进行p65含量的免疫印迹检测,发现Atsttrin能有效抑制TNF介导的p65的核转移。为进一步明确Atsttrin能否抑制NF-KB的活性,我们将具有荧光的NF-KB质粒转染到软骨细胞中,并进行培养。研究发现,Atsttrin能显著降低NF-KB的活性。综上,Atsttrin有效抑制TNFα介导的炎症性分解代谢。本实验研究发现,Atsttrin能够通过至少两种路径在骨关节炎中发挥保护作用：1)直接与]NFR2结合,激活Akt,Erk1/2信号通路,从而激活合成代谢；2)与TNFα竞争性结合TNFR1,拮抗TNFα介导的炎症性分解代谢。此研究不仅提供了Atsttrin在关节稳态中发挥的作用,而且说明Atsttrin在以后有可能成为治疗骨关节炎的潜在方案之一。全关节置换术是全世界广泛采用的治疗严重关节疾病,如类风湿性关节炎,骨关节炎的方案之一,能够有效缓解病人疼痛并提高病人生活质量。每年,全世界约进行有150万人次的膝关节及髋关节置换手术,并且这种关节置换手术的需求正在逐年增加。关节置换除了几个众所周知的优点外,也有一些并发症,其中,关节置换术后翻修成为了一个主要问题。在所有并发症中,无菌性假体松动和假体周围骨溶解是关节置换手术之后失败的主要原因。而这些主要是由于金属颗粒,如钛金属颗粒对周围组织发生的生物学反应而引起的。无菌性假体松动是关节置换术后一个主要的并发症,以缓慢性疼痛,慢性炎症及骨与假体之间发生骨溶解为主要特点。Progranulin (PGRN)能够与肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor receptors, TNFRs)相结合并拮抗TNF发挥抗炎作用。考虑到TNF在无菌性假体松动发生发展过程中水平升高,并研究报告TNF在无菌性假体松动中发挥关键性作用,而且TNF抑制剂在无菌性假体松动的动物模型中表现出良好的疗效,我们提出假设,progranulin能够通过抑制TNF来预防或治疗由钛金属颗粒引起的炎症性骨溶解。首先,为确定progranulin的表达在钛金属颗粒诱导的无菌性假体松动过程中是否发生改变,我们采用RAW细胞系作为研究对象。RAW是巨噬细胞系,在炎症反应过程中发挥了重要作用。研究发现,经过钛金属颗粒刺激后,收集RAW细胞的蛋白及RNA进行检测。实验表明,钛金属颗粒能够显著刺激progranulin的基因及蛋白表达。为进一步明确在体内,钛金属颗粒能否促进progranulin的表达,我们建立了钛金属颗粒诱导的空气诱导的空腔模型。待模型成功构建后,我们取出组织,进行免疫组织化学染色分析,发现progranulin在体内在钛金属颗粒的诱导下表达明显升高。虽然钛金属颗粒可以在体内及体外诱导progranulin的表达,但是progranulin的升高并不能完全中和钛金属颗粒引发的炎症性反应。为进一步明确内源性progranulin在钛金属颗粒诱导的炎症反应中的作用,我们在progranulin敲击因鼠和相同基因背景的野生型小鼠体内建立了钛金属颗粒诱导的空气空腔模型。待模型构建成功后,取出新鲜组织及小鼠的血液,将小鼠组织分别制作病理切片,提取蛋白质和RNA。研究发现,敲除progranulin之后,钛金属颗粒诱导的小鼠炎症反应明显加重。除此之外,组织中前炎症性因子,如TNF,IL-1,IL-6,NOS-2,COX-2的基因表达在progranulin敲击因鼠中较野生型小鼠明显升高。更进一步的,progranulin敲击因鼠血液中炎性因子如IL-1和IL-6的水平比野生型小鼠明显增高。以上数据表明,内源性progranulin在钛金属颗粒诱导的炎症反应中发挥重要作用。为明确重组progranulin能否抑制钛金属颗粒诱导的炎症性反应,我们在野生型小鼠体内建立了钛金属颗粒诱导的空气腔模型,小鼠模型建立之后,予以PBS或progranulin治疗。待模型治疗完成后,取出新鲜组织及小鼠的血液,将小鼠组织分别制作病理切片,提取蛋白质和RNA。研究发现,予以重组progranulin治疗之后,钛金属颗粒诱导的小鼠炎症反应明显减轻。除此之外,组织中前炎症性因子,如TNF,IL-1,IL-6,NOS-2,COX-2的基因表达在重组progranulin治疗鼠中较PBS治疗小鼠明显降低。更进一步的,progranulin治疗小鼠血液中炎性因子如IL-1和IL-6的水平比PBS治疗小鼠明显降低。以上数据表明,重组progranulin能有效抑制钛金属颗粒诱导的炎症反应。为明确重组progranulin能否抑制钛金属颗粒诱导的骨溶解,我们建立了体外培养颅骨实验。我们用常规培养基和条件性培养基对小鼠颅骨进行体外培养。条件性培养基为常规培养基和钛金属颗粒刺激过的培养基按1：1比例配置。经过一段时间培养后,将小鼠颅骨常规固定,脱钙,制作为病理切片。TRAP发现,钛金属颗粒能够促进破骨细胞生成,而progranulin能够抑制钛金属颗粒的促进作用。将小鼠颅骨匀浆后提取RNA,发现progranulin能显著抑制钛金属颗粒促进的破骨细胞标志物的表达。为进一步明确progranulin能否抑制钛金属颗粒介导的骨溶解,我们建立了钛金属颗粒诱导的颅骨溶解模型。MicroCT显示progranulin能有效抑制钛金属颗粒诱导的颅骨溶解。TRAP染色显示在颅骨溶解体内模型中,progranulin能显著降低破骨细胞的生成。更重要的是,progranulin能够促进胶原的合成,促使溶解部分进行修复。进一步的,我们将骨髓干细胞分离出来,将其向破骨细胞分化,发现钛金属颗粒能够促进破骨细胞生成,而progranulin能有效抑制钛金属颗粒的这种抑制作用。以上数据表明,progranulin在体内能抑制钛金属颗粒诱导的骨溶解,而progranulin的这种抑制作用可能通过抑制破骨细胞的生成和活性来实现的。为进一步探索其可能的分子机制,我们采用RAW细胞系进行机制学研究。研究发现,progranulin能显著抑制钛金属颗粒诱导的致炎因子的基因表达,如IL-1,IL-6。同时,我们收集了培养基上清液,进行ELISA检测,发现培养基中的前炎症性因子的释放也显著降低。考虑到TNF-NF-KB信号通路是经典的信号通路,为进一步明确progranulin是否通过抑制NF-KB信号通路发挥作用,我们用免疫组织化学染色分析,发现在小鼠体内,progranulin治疗组中IKB的磷酸化显著降低。同时,我们发现,钛金属颗粒能够促进p65由细胞浆内转移到细胞核内,而progranulin能够有效的抑制这一过程。更进一步的,progranulin还能显著抑制钛金属颗粒诱导的NF-KB活性的升高。总之,progranulin能够通过抑制TNF-NF/KB信号的活化,核转移以及NF-KB的活性来抑制钛金属颗粒诱导的炎症性骨溶解。