研究背景和目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生于鼻咽粘膜的一种上皮来源的恶性肿瘤,具有明显的地区聚集性,高发于我国南方和东南亚地区。流行病学研究表明鼻咽癌的发生受环境和遗传双重因素的影响,其中EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)既是诱发鼻咽癌发生的环境因素,在感染后又可整合到基因组影响基因表达。在高发区未分化的鼻咽癌(WHO Ⅲ型)占绝大多数,并且均与EBV的感染有关。研究表明EBV的潜伏感染可能是NPC发生的第一步。EBV在体内主要感染两类细胞：B淋巴细胞和上皮细胞。EBV可高效感染B淋巴细胞且机制已非常明确,即EBV通过其表面糖蛋白gp350/220与B淋巴细胞上的表面抗原CD21 (CR2)结合进入淋巴细胞而发生感染,对B细胞的增值、分化及记忆均起重要的调节作用。CR2,即CD21,又名EB病毒受体,是补体激活调节剂家族的一员。CR2是一个分子量为145kD的单链糖蛋白,其N端在胞外,含20个氨基酸的疏水信号肽及1005个氨基酸的膜外区,接着是24个氨基酸的疏水跨膜区,C端由34个氨基酸构成胞浆尾。CR2膜外部分有15个(或16个)短的同源重复序列(SCRs),每个SCR含60-75个氨基酸。CR2与EBV结合表位基本清楚,SCR1-2为CR2与EBV的gp350/220, C3dg结合所必需的表位,SCR3-4对诱导CR2与EBV的结合也起一定作用。研究表明CD21是B淋巴细胞系最早期的表面标志物,最早开始表达于B细胞的前体细胞,并且CD21在一些祖细胞及肿瘤干细胞中表达,如在祖细胞中与SOX2等共表达。EBV能有效感染B淋巴细胞,特别是CD21在EBV感染B淋巴细胞的干细胞中起着决定性的作用,且胎儿骨髓中的B淋巴细胞系认为是B细胞祖细胞及前体细胞,研究证实这些细胞更容易被EBV感染。但是EBV很难感染上皮细胞,即便是EBV成功感染上皮细胞,也很容易造成EBV的丢失,而EBV在上皮组织中的稳定维持需要未分化的细胞环境。EBV感染上皮细胞的效率很低,特别是游离的EBV很难感染上皮细胞,EBV感染上皮的机制有待进一步研究。到目前为止,认为EBV能感染上皮的方式主要通过细胞与细胞间接触感染,即EBV首先通过B淋巴细胞表面抗原CD21而感染B淋巴细胞,被感染的B淋巴细胞游走至上皮细胞,通过细胞间接触(EBV可能通过B细胞上的CD21通道)进而感染上皮细胞。即首先在活体内EBV是通过唾液感染口咽部的B淋巴细胞,再通过细胞间接触感染毗邻的复层鳞状上皮,从而导致鼻咽上皮细胞的EBV感染。而游离的EB病毒则很难进入上皮细胞,只有当基底膜破损时,可以通过破损处进入上皮细胞发生感染。CR2在B淋巴细胞表达率很高但是在上皮中的表达很低,甚至有报道是阴性表达,然而在上皮细胞中过表达CR2可以提高EBV对上皮细胞的感染效率,这说明CR2对EBV感染上皮细胞起到重要作用。CR2在上皮细胞的表达情况目前尚有争议,游离的EBV是否可以通过CR2途径进入上皮细胞发生感染而促进鼻咽癌的发生尚未明确。因此我们首先要证实正常人体鼻咽上皮细胞是否有CR2(CD21)的表达。由于鼻咽癌患者通常伴随鼻咽炎的发生,而炎症处必然有大量B淋巴细胞的聚集,这对检测鼻咽上皮细胞CR2的表达情况造成干扰。因此本研究采用免疫组化技术检测不同胎龄胎儿鼻咽上皮细胞中CR2的表达情况,同时与上皮干细胞标志物CD133的表达情况及上皮细胞分化标志物CK5的表达情况进行比较,从而在体内证实鼻咽上皮中是否有CD21的表达及其与干细胞可能的关系。由于使用普通的实验方法如Western Blot,Q-PCR等方法很难检测到CD21表达的阳性结果,所以在体外实验我们利用流式细胞仪检测(具有高精确度)并比较鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中及正常上皮细胞株NP69中CD133及CD21的含量；使用细胞免疫荧光及其双标实验、肿瘤球免疫荧光实验、肿瘤球的分化及Brdu标记滞留细胞实验等多种方法验证CD21在鼻咽癌细胞或鼻咽正常上皮细胞中的表达情况。如果能检测CD21阳性表达的结果,接下来用游离的EBV感染以上各细胞系,EBV感染一段时间后检测EBV潜伏感染时表达的核蛋白EBNA1的表达情况。为了进一步确定EBV是否通过结合CD21而进行上皮细胞潜伏感染,我们使用免疫荧光双标方法检测EBNA1与CD21的共表达情况,并将各细胞株中CD21抗原进行封闭,封闭后再用游离EBV感染各细胞系,并检测EBNA1表达。同时观察封闭后与未封闭细胞被EBV感染后各细胞株形态学变化及相关恶性表型的改变。研究内容与方法1、不同胎龄的胎儿鼻咽上皮各壁中CD21、CD133及CK5的表达分布特点使用免疫组化的方法检测不同胎龄胎儿的鼻咽上皮组织各个壁中CD21、 CD133及CK5的表达情况及随着上皮细胞的分化这些指标的变化情况,根据免疫组化的结果分析鼻咽上皮各壁中CD21、CD133及CK5的表达含量,并推测鼻咽上皮干细胞可能的所在部位,初步确定CD21与鼻咽上皮干细胞及其分化的关系。2、体外实验证实CD21在鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞株中及其干细胞中的表达1)流式细胞仪分别检测CD21+及CD133+的细胞含量采用流式细胞仪分别检测正常鼻咽上皮细胞株NP69及人高分化鼻咽癌细胞株CNE1、人低分化鼻咽癌细胞株CNE2中CD21+、CD133+细胞的含量,并进行比较分析。2)细胞免疫荧光实验免疫荧光实验检测NP69及鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2中CD21、CD133的表达情况,并用免疫荧光双标的实验方法检测与观察CD21与CD133在这些细胞株中是否共表达。3)细胞株体外标记滞留(Label Retaining cells, LRCs)实验鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2及鼻咽上皮细胞株NP69细胞生长至指数期时,向培养基中加入Brdu(10ng/ml),培养2小时后,撤除Brdu继续培养14天,培养过程中,分别在Brdu加入后2h及撤除Brdu后的第14天进行细胞免疫荧光染色。4)检测LRCs细胞与表达CD21、CD133的细胞是否吻合使用细胞免疫荧光的方法分别同时标记LRCs与CD21, LRCs与CD133,并检测及分析。5)肿瘤球的免疫荧光实验培养鼻咽癌细胞株的肿瘤球,然后采用免疫荧光的方法检测肿瘤球上CD21、CD133及CK5的表达,并用免疫荧光双标的方法检测CD21及CD133在肿瘤球中的共表达情况。6)肿瘤球分化实验培养肿瘤球并使其分化,用免疫荧光的方法检测随着肿瘤球的分化CD21、 CD133及CK5的表达的变化。3、游离的EBV感染鼻咽上皮细胞1)游离EBV抽提实验培养B95-8细胞,培养一段时间后收集B95-8细胞培养液,在4℃离心机离心,取上清,将上清用0.22μm一次性过滤器过滤得到纯的EBV浓缩液。2) EBV感染实验游离的EBV分别使用相同的病毒滴度感染正常鼻咽上皮细胞NP69及鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2。3) EBV感染后EBNA1的检测EBV感染5-10天后,采用细胞免疫荧光的方法分别检测NP69、CNE1及CNE2中EBNA1的表达。4) EBV感染后细胞形态学的观察EBV感染后的细胞,在光学显微镜下观察各细胞株形态学的改变,并与对照组进行比较。5) EBV感染后细胞骨架的检测检测EBV感染后及对照组细胞的细胞骨架,观察细胞骨架迁移性伪足及刺突的改变情况。4、证实游离的EBV是否通过CD21途径发生感染1)细胞免疫荧光双标实验EBV感染10天左右,采用细胞免疫荧光方法检测EBNA1与CD21的共表达情况。2)CD21封闭实验首先用CD21抗体将各细胞株中的CD21抗原进行封闭,封闭后再行EBV感染。3)CD21被封闭的细胞株在EBV感染后EBNA1、细胞骨架的检测及细胞形态学观察5、统计学分析：采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。鼻咽上皮各壁中不同抗原的阳性表达量及比较采用重复测量的方差分析,不同细胞株中各检测抗原的阳性表达量及不同抗原间表达量的比较等均采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义；计量资料结果用mean±s表示。结果：1、胎儿鼻咽上皮各部位CD21与CD133表达特点1)胎儿鼻咽上皮的CD21表达具有时空差异结果发现CD21在小胎龄胎儿鼻咽上皮呈强阳性高表达,且细胞浆及细胞核均表达,14w、20w及26w时在鼻咽各壁表达总量分别为32.15±27.06%,16.96±16.96%,7.74±8.32%,随着胎龄的增加CD21表达降低,各胎龄之间有显著性差异(F=607.296,P=0.000)；将鼻咽分为9个部位,在前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达总量分别为10.00±5.43%,0.78±0.97%,0.00±0.00%,39.00±20.04%,24.56Q14.83%,3.89±2.98%,51.22±23.82%,25.22±16.02%,15.55±15.06%,各部位之间有显著性差异(F=604.844,P=0.000)。其中CD21在顶后壁表达最高,且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阳性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阴性表达。2)胎儿鼻咽上皮的CD133表达具有时空差异CD133在14w、20w及26w鼻咽上皮的表达分别为31.15±26.48%,16.96±17.12%,7.52±8.17%,各胎龄之间有显著性差异(F=480.029,P=0.000)；在前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达总量分别为9.67±5.70%,0.78±1.09%,0.00±0.00%,39.00±20.00%,25.22±14.29%,3.78±2.82%,50.78±24.00%,23.22±13.92%,14.444±13.35%,部位之间有显著性差异(F=637.724,P=0.000)。 CD133在顶后壁表达最高,且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阳性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阴性表达。3)CD21与CD133在不同胎龄鼻咽上皮各部位表达比较14w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显著差异(F=0.500,1.000,-,0.180,0.000,0.000,0.756,1.512,1.387；P=0.667,0.423,-,0.874,1.000,1.000,0.529,0.270,0.300)；20w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显著差异(F=1.000,1.000,-,0.555,0.394,0.000,0.500,0.378,0.500；P=0.423,0.423,-,0.635,0.732,1.000,0.667,0.742,0.667)；26w时,CD21与CD133在的鼻咽前段顶壁、前段侧壁、前段底壁、中段顶壁、中段侧壁、中段底壁、后段顶壁、后段侧壁及后段底壁的表达均无显著差异(F=1.000,-,-,0.000,2.000,1.000,0.346.1.000,1.000：P=0.423,-,-,1.000,0.184,0.423,0.762,0.423,0.423)。4)胎儿鼻咽上皮各部位CK5表达不同步CK5在14w、20w及26w鼻咽后段的表达总量分别为29.22±8.67%,70.33±16.71%,49.22±33.38%,不同胎龄间有显著差异(F=151.252,P=0.000)；在鼻咽后段顶壁、侧壁及底壁的表达分别是35.44±16.93%,46.67±18.87%,66.67±34.85%,不同部位间有显著差异(F=114.898,P=0.000)。且所有皱襞陷凹部位的细胞呈阴性表达,陷凹接近顶部处及非陷凹处呈阳性表达。胎儿鼻咽上皮免疫组化结果显示CD21的表达变化特点与CD133同步,而CD133已作为广泛的成体干细胞标志物,特别是最近有报道认为CD133可作为鼻咽癌的干细胞标志物之一,根据我们的实验结果显示CD133在早期胎儿的鼻咽上皮高表达,随着分化成熟,CD133的表达下调,且同时检测的CK5(上皮组织早中期分化指标),CD133一直表达的部位CK5是不表达的,可见CD133表达的部位可能是未分化部位,同时CD21可能也在鼻咽上皮未分化的细胞表达。但是随着胚胎的发育成熟,在胎儿出生后甚至成人的鼻咽上皮组织中,CD21是逐渐消失还是仍表达会少量表达尚未知,为此我们进一步探讨及研究。2、体外实验检测CD21在鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞株上的表达1)流式细胞仪检测结果显示在鼻咽正常上皮细胞NP69中CD21+、CD133+的含量分别为0.53±0.06%、0.50±0.1%,两者间无显著差异(t=0.500,P=0.643)；鼻咽癌高分化细胞株CNE1中CD21+、CD133+的含量分别为0.17±0.06%、0.23±0.1%,两者间无显著差异(t=-1.414,P=0.230)；鼻咽癌低分化细胞株CNE2中CD21+、CD133+的含量分别为1.03±0.15%、1.3±0.2%,两者间无显著差异(t=-1.835,P=0.140)。2)细胞免疫荧光显示在NP69及CNE2中分别可见少量的CD133+、CD21+细胞,且阳性细胞大小显著小于阴性细胞,均表达与细胞的胞浆及胞膜。免疫荧光双标实验显示CD133+、CD21+细胞是完全重合的。3)细胞株体NP69及CNE2的LRCs特点为细胞核显著小于非LRCs的细胞核,且CD133+和CD21+细胞分别与LRCs完全重合。4)鼻咽癌细胞株的肿瘤球表达CD133及CD21,且二者可重合,而不表达CK5。5)随着肿瘤球的分化CD133及CD21的表达逐渐下调,最终只在肿瘤球中心少量细胞仍可表达CD133及CD21,而CK5随着肿瘤球的分化表达逐渐增多。3、游离EBV依赖CD21途径潜伏性感染鼻咽上皮细胞并导致恶性表型1)游离EBV感染NP69、CNE1及CNE2后检测EBNA1的表达,结果NP69及CNE2显示只有少量的细胞(1%左右)可检测到EBNA1的表达,而CNE1细胞在感染EBV后发生裂解性死亡。2)游离EBV感染后NP69及CNE2细胞中有少量细胞共表达CD21与EBNA1, CD133与EBNA1,并发生显著的形态改变,NP69有少量细胞由长梭形变成多角形,即细胞伪足增多,CNE2由类圆形变成长梭形。3)游离EBV感染后NP69及CNE2细胞中有少量细胞的细胞骨架发生显著变化,被感染的NP69及CNE2细胞侵袭性伪足均增多,刺突增多,出现显著的恶性表型。4)NP69、CNE1及CNE2细胞株的CD21被封闭后进行EBV感染,结果显示NP69及CNE2均检测不到EBNA1的表达,也未观察到细胞形态及细胞骨架的改变,而CNE1仍然会发生裂解性坏死。鼻咽癌细胞的感染感染主要为Ⅱ型潜伏感染,可表达EBV编码的EB病毒核抗原1(EBNA1)。我们的实验结果显示EBV可以通过CD21途径造成少量细胞的潜伏性感染进从而造成细胞恶性表型的发生。