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[研究背景]冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Disease, CAD)，简称冠心病,是一种严重危害人类健康的世界性疾病。在其发生过程中,环境因素如吸烟等起着重要的作用,同时遗传因素在其中的作用也已经得到公认。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的主要危险因素。血液中高水平的LDL胆固醇总是与CAD发病风险的升高密切相关,而高水平的HDL胆固醇可以降低CAD的发病风险。家系研究表明,LDL、HDL和TG等血脂水平受到个体遗传背景的影响。最近的全基因组关联研究也发现了多个可显著影响血脂水平的基因座,而且这些基因座上的遗传多态同样与CAD的发病密切相关。ABCA1与ABCG1是ATP结合盒式转运子超家族中的两个成员,它们通过相互独立的机制参与调节胆固醇代谢平衡,促进细胞内胆固醇和磷脂向HDL转运,避免外周细胞胆固醇严重沉积。ABCA1基因常见多态性与血浆脂质水平和CAD易感性有着一定的关联,ABCA1基因的缺失更可导致易患动脉粥样硬化的丹吉尔病。但ABCG1在动脉粥样硬化发生发展中的作用仍然没有完全明确。通过移植Abcgl-l-小鼠的骨髓,动脉粥样硬化模型鼠仅仅出现了轻度的病变减轻甚至发生病变面积的增加。鉴于体内总ABCG1的表达可以阻止动脉粥样硬化病变进一步发展的事实,人们通常还是认为ABCG1对动脉粥样硬化具有保护作用。[研究目的]应用基于群体的病例-对照关联研究,探讨ABCG1基因与山东汉族人群CAD发病和病情严重程度的相关性,并初步验证ABCG1基因启动子区域单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism, SNP)对基因转录活性的影响。[研究方法]基于群体的病例-对照关联研究：1.收集CAD患者541例和正常对照649例血样,提取基因组DNA,对研究对象临床资料进行统计描述。根据CAD患者冠脉狭窄程度,将病例组分为Gensini积分大于45和小于等于45的两组,进行病例组内的分析。2.选取ABCG1基因上游启动子区域的三个SNP rs4148082、rs1893590、rs1378577,位于第7内含子的tag SNP rs225374,位于3’非翻译区(3’UTR)的tagSNP rs1044317,通过PCR-RFLP法进行基因分型。3.分别计算各SNP位点基因型与等位基因在病例组与对照组中的频率,并进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检测,以确定选取的SNP位点在病例组与对照组中均处于遗传平衡状态,具有群体代表性。分析各SNP位点间连锁不平衡状况,计算D’和r2值。4.采用logistic回归模型法分析各SNP位点与疾病表型的相关性,分别在广义模型、乘法模型、显性模型、隐性模型和加法模型假定下进行统计推断,通过比较各遗传模型推断结果,确定遗传模型,得出合理的结论。ABCG1基因启动子区域SNP对基因转录活性影响的初步验证：1.根据基因库中的基因组序列信息,采用Mat Inspector软件对ABCG1基因转录起始点上游约lkb序列进行转录调控元件分析。2.在前面基因分型结果的基础上,采用荧光素酶报告基因分析系统,构建四种包含不同ABCG1基因启动子单体型的表达载体,分别瞬时转染HeLa细胞和HEK293T细胞,再用22(R)羟基胆甾醇(22(R)-hydroxycholesterol)和9-顺-视磺酸(9-cis-retinoic acid)进行诱导,检测荧光素酶表达活性。[结果]1.ABCG1基因各SNP位点在病例组与对照组中均处于遗传平衡状态,具有群体代表性。启动子区域的三个SNP rs4148082,rs1893590,rs1378577间处于相对较强的连锁不平衡状态,tag SNP rs225374,rs1044317与其它SNP位点间处于非常弱的连锁不平衡状态。2.启动子区域的三个SNP rs4148082,rs1893590,rs1378577各基因型及等位基因频率分布在CAD组与对照组中没有统计学差异(P>0.05)。而rs225374等位基因C在病例组中的频率高于对照组,具有统计学意义(OR=1.186,95%CI：1.009-1.394,P=0.039)。rs1044317等位基因A在病例组中的频率高于对照组,也具有统计学意义(OR=1.187,95%CI：1.009-1.397,P=0.039)。tag SNPrs225374,rs1044317在加法模型下同样与CAD发病具有相关性。3.在女性病例组内分析中,启动子区域的三个SNP rs4148082,rs1893590,rs1378577罕见等位基因在女性高Gensini积分组中的频率高于女性低Gensini积分组,并具有统计学意义,在加法模型下与女性CAD严重程度具有相关性。而此三个SNP位点在男性病例组内及全部病例组内分析中未发现相关性。tag SNPrs225374,rs1044317在病例组内分析中未发现相关性。4.成功构建四种包含不同ABCG1基因启动子单体型的荧光素酶报告基因表达载体。在转染HeLa细胞、HEK293T细胞后,荧光素酶活性检测结果显示rs4148082,rs1893590,rs1378577所组成的单体型GAT活性显著高于单体型GCG,而单体型GAG与单体型GCG活性无明显差异。[结论]1.ABCG1基因tag SNP rs225374, rs1044317在山东汉族人群中与CAD发病呈现一定的相关性。2.ABCG1基因启动子区域的三个SNP rs4148082,rs1893590,rs1378577在山东汉族人群中与女性CAD严重程度呈现显著的相关性。3.rs1378577等位基因G可以显著下调ABCG1基因转录活性。rs1893590对ABCG1基因转录活性无明显影响,仅由于较强的连锁不平衡状态而呈现相关性。