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红茶是指以茶树(Camellia sinensis(L.)O.Ktze.)的新鲜叶或是芽经萎凋、揉捻(切)、发酵和干燥四个初制工艺加工而成的一种茶叶品种,发源于中国福建,色香味俱全且有多种生理功能。红茶中含有多酚、多糖和氨基酸等多种生物活性物质与红茶保健功能息息相关,其中与红茶保健作用相关性最高的是茶黄素类物质(theaflavins,TFs)。茶黄素类物质在红茶中的含量极低,仅占到红茶干重的0.5-2%,由于缺乏足量的样品,这为更好地研究茶黄素的生物活性带来了困难,因此本文选择从茶黄素-3,3’-O-双没食子酸酯(theaflavin-3,3’-O-digallate,TFDG)入手,以期研究出一种酶促反应大量制备TFDG的方法。茶黄素的抗氧化、抗炎症、抑制肿瘤等生物功能突出,而受到国内外学者的广泛研究,但是针对TFDG对双氧水引起的RAW264.7细胞氧化损伤保护作用却未见报道;TFs由于其分子量较大、羟基含量多的分子结构特点,根据现有报道一般认为其不能被肠道直接吸收利用,而对于其能否以固有分子结构进入肠道被利用鲜见报道。本课题以从皇冠梨(pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)中提取的多酚氧化酶(polyphnol oxidase,PPO)催化表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)合成TFDG,并对合成条件进行了优化;研究了 TFDG在模拟唾液、胃液和胰液中的稳定性;利用化学体系和RAW264.7细胞氧化损伤模型研究了 TFDG的抗氧化生理功能。主要内容及结果如下:1、TFDG的酶法合成、分离纯化及其机构鉴定为优化梨PPO催化合成TFDG的最优条件,选择pH、温度和EGCG/ECG物质的量比这3个与酶促反应密切相关的因素分别进行单因素试验。在单因素试验的基础上选取pH、温度和EGCG/ECG物质的量比3个因素进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计,再根据软件模型进行优化,得出PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的最优理化条件:pH4.10、温度36.99℃及EGCG/ECG物质的量比例3.09,在此条件下由公式计算得出的理论值为84.63%。为方便试验进行选取EGCG/ECG物质的量比例3.1、pH4.10、温度37℃进行验证试验,得到TFDG产率为85.14%±0.4%,与软件模拟相符合。在最优条件下合成TFDG,反应液上样于AB-8层析柱,先用水作为洗脱剂去除一些不能被树脂吸附的物质,再用90%乙醇作为洗脱剂洗脱TFDG,并收集冻干。选用的两相系统为水-乙酸乙酯-正己烷-甲醇(6:3:1:1,V/V/V/V),TFDG粗品以上相溶解后用高速逆流色谱仪分离得到高纯度的单体。单体经1H NMR和MALDI-TOF-MS鉴定,分子结构和分子量与文献吻合,确认所得物质为高纯度的TFDG单体。2、TFDG的体外模拟消化及其对Caco-2细胞炎症的保护作用本章利用体外模拟消化体系研究了 TFDG在模拟口腔、胃液和胰液中的稳定性;并且用.Caco-2单层细胞模型模拟了小肠壁细胞对TFDG的消化和转运;以LPS介导的Caco-2细胞炎症模型研究了 TFDG对肠道细胞炎症的保护作用。结果表明,TFDG在模拟唾液和模拟胃液中性质基本稳定,而在模拟胰液中会被部分的降解,但是降解产物未能检测到;在Caco-2单层细胞模型中,单层细胞模型不能把TFDG从上室转移到下室,说明TFDG的肠道吸收较差,且在100min的模拟肠道消化的过程中,TFDG也不会被Caco-2单层细胞模型分泌的各种消化酶类所降解;LPS介导的Caco-2细胞炎症模型中,LPS可以使得Caco-2细胞中的炎症水平升高,而TFDG能够显著性地(p<0.05)降低Caco-2细胞中TNF-α和IL-8的水平,表明TFDG对于Caco-2细胞炎症反应有一定的缓解作用。3、TFDG的抗氧化活性研究本章利用化学体系方法(包括清除超氧阴离子自由基、总还原力、清除ABTS自由基和抗脂质过氧化能力)和双氧水诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞氧化损伤模型法来系统地评价TFDG的抗氧化能力。化学体系抗氧化试验表明TFDG清除超氧阴离子自由基、总还原力、清除ABTS自由基和抗脂质过氧化能力这四个抗氧化水平指标均与VC相当。双氧水诱导的RAW264.7细胞氧化损伤模型中,双氧水可以显著地升高RAW264.7细胞中氧化应激水平,而TFDG可以显著地(p<0.05)降低细胞由于脂质过氧化而形成的丙二醛(MDA)的含量,激活抗氧化酶类GSH-PX、CAT和SOD活力升高。说明TFDG能有效减轻双氧水引起的RAW264.7细胞氧化损伤反应。