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番茄黄化卷叶病毒病是出现在番茄生产上的一种危害程度高,传播广泛的病害。Ty-1、Ty-2和Ty-3这三个基因是主要的抗病基因。本研究以番茄黄化卷叶病毒抗病纯合体(Ty-1/Ty-1、Ty-2/Ty-2和Ty-3/Ty-3)、抗病杂合体(Ty-1/ty-1、Ty-2/ty-2和Ty-3/ty-3)和感病纯合体(ty-1/ty-1、ty-2/ty-2和ty-3/ty-3)为实验材料,参考已发表的相关文献设计适合的特异性引物,首先获得了Ty-1、Ty-2和Ty-3这三个抗病基因各自单独、稳定的分子标记,接着在此基础上建立了能够同时鉴定上述三种基因的多重PCR体系。Ty-1基因的分子标记:利用引物TY-1F/TY-1R对实验材料在经PCR扩增后,所有的材料均出现了398 bp的特异片段。经Taq I酶酶切后,感病纯合基因型的还是只有出现398 bp的片段;抗病纯合基因型材料出现303 bp和95 bp两个片段;抗病杂合基因型材料出现398 bp、303 bp和95 bp三个片段。其引物序列为TY-1 F:5’-TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T-3’、TY-1 R:5’-CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A-3’。Ty-2基因的分子标记:利用引物TY-2F/TY-2R对实验材料进行PCR扩增,抗病纯合基因型材料只扩增出900 bp的片段;感病基因型材料只扩增出800 bp的片段;而抗病杂合基因型材料则同时扩增出800 bp和900 bp两条片段。其引物序列为TY-2F:5’-TGG CTC ATC CTG AAG CTG ATA GCGC-3’;TY-2R:5’-AGT GTA CAT CCT TGC CAT TGACT-3’。Ty-3基因的分子标记:利用引物TY-3F/TY-3R对实验材料进行PCR扩增,感病基因型材料只扩增出320 bp的片段;抗病纯合基因型材料只扩增出450 bp的片段;而抗病杂合基因型材料同时扩增出320 bp和480 bp两条特异片段。标记引物序列为TY-3F:5’-GGT AGT GGAAAT GAT GCT GCT C-3’;TY-3R:5’-GCT CTG CCT ATT GTC CCA TAT ATAACC-3’。以上述三个稳定的单一PCR体系为基础,先建立一个双重PCR体系,即:同时检测抗病基因Ty-1和Ty-2抗病基因的双重PCR体系。接着在这个双重PCR体系的基础上,将TY-1、TY-2、TY-3这三个引物对同时加入一个PCR体系中,反复优化底物浓度,引物比例,退火温度等实验条件,最终建立了同时检测抗病基因Ty-1、Ty-2和Ty-3的三重PCR体系。利用得到的同时鉴定Ty-1、Ty-2和Ty-3这三个基因的多重PCR技术对基因型不祥的植株进行抗病基因型鉴定,检测出了台湾天瑞F2代分离群体的抗病基因为Ty-1。筛选出了9个符合抗病育种要求的育种材料,品种编号分别为:1501、1524、1525、1539、1541、1543、1549、1550、1553,其中基因型为Ty-1/Ty-1;ty-2/ty-2;ty-3/ty-3的有4个,品种编号为1525、1539、1549、1550。基因型为Ty-1/ty-1;ty-2/ty-2;ty-3/ty-3的有3个,品种编号为1501、1524、1553。基因型为ty-1/ty-1;Ty-2/Ty-2;ty-3/ty-3的有1个,品种编号为1541。基因型为Ty-1/Ty-1;ty-2/ty-2;Ty-3/Ty-3的有1个,品种编号为1543。此多重PCR技术为今后的抗病育种材料的鉴定和辅助选择育种提供了更加快捷、方便的性途径,有望应用于番茄今后的抗病育种工作中。