【摘 要】
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AMPs（Antimicrobial peptides,AMPs）是一类由特定基因编码的小分子多肽,广泛分布于各种生物中,是生物天然免疫的重要效应分子。家蝇Defensin是家蝇抗菌肽家族中重要的一员,在抵御外源微生物入侵的过程中发挥着重要的作用,该抗菌肽的抗菌机制目前尚不清晰。在应用上目前也并未有家蝇Defensin作为天然肽类防腐剂用于食品的防腐保鲜研究。鉴于此,本研究针对家蝇蛹中鉴定出的De
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AMPs（Antimicrobial peptides,AMPs）是一类由特定基因编码的小分子多肽,广泛分布于各种生物中,是生物天然免疫的重要效应分子。家蝇Defensin是家蝇抗菌肽家族中重要的一员,在抵御外源微生物入侵的过程中发挥着重要的作用,该抗菌肽的抗菌机制目前尚不清晰。在应用上目前也并未有家蝇Defensin作为天然肽类防腐剂用于食品的防腐保鲜研究。鉴于此,本研究针对家蝇蛹中鉴定出的Defensin抗菌肽,设计并合成了家蝇Defensin抗菌肽及其截短肽,测定了它们的最小抑菌浓度,系统开展了Defensin及其截短肽Def-a3的膜作用和非膜作用抗菌机制,并评估了Defensin和Def-a3等抗菌肽对冷却肉防腐保鲜效果,测定了其对人红血细胞的溶血活性。主要研究内容如下:（1）在细菌诱导的家蝇蛹蛋白中共鉴定出Domesticin,Antifungal peptide-1,Attacin,Cecropin,Lysozym,Sarcotoxin II和Defensin等7种抗菌肽。其中家蝇Defensin抗菌肽属于Defensin 2家族,成熟肽由40个氨基酸组成,包含6个半胱氨酸残基。设计并利用固相合成的方法合成了家蝇Defensin抗菌肽及其截短肽Def-a1,Def-a2和Def-a3,分子量分别为3995.58 Da、997.21 Da、1039.30 Da和1152.45 Da。所有四种抗菌肽均是碱性抗菌肽,Def-a3的等电点（PI）高达12.48。（2）抗菌肽MIC测定结果表明,Defensin对四种供试细菌（Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia coli和Salmonella enterica）的MIC在23.67-65.67μg/ml之间。而截短肽Def-a3对供试细菌的抗菌效果优于Defensin,其对四种供试细菌的MIC在7.30-41.00μg/ml之间。Def-a1和Def-a2抗菌活性较低。Defensin对Nisin抗革兰氏阳性菌（S.aureus和L.monocytogenes）有着很好的增效作用,尤其是对L.monocytogenes,其共毒系数为534.87,远远高于120。而Def-a3对Nisin仅对L.monocytogenes具有明显增效作用,共毒系数为212.53。（3）细菌细胞膜透过率和磷离子泄漏测定结果表明,与未经AMPs处理的正常细菌相比,Defensin和Def-a3两种抗菌肽均可造成四种细菌细胞膜通透性增加以及细菌细胞外的无机磷酸盐浓度增加;透射电子显微镜检测结果发现Defensin和Defa3处理细菌后,细菌细胞膜也发生了变形与褶皱,有明显的细胞内物质泄露,电子密度降低、不均匀,形成空腔。其中Def-a3处理李斯特菌后,细胞膜出现了轻微的破损及孔洞;激光共聚焦显微镜研究表明两种肽都能在很短的时间内进入细菌细胞;流式细胞仪对细胞损伤情况检测结果发现Defensin和Def-a3处理细菌1分钟后,2种细菌中检测到的PI信号都已达到了75%左右。（4）DNA电泳迁移率变动分析结果显示Def-a3可以在较短的时间内与细菌DNA发生结合,并且这种结合能力具有浓度依赖性,而Defensin与四种细菌的DNA不能结合;Defensin及Def-a3处理细菌后,导致dna B和rec A基因的上调,ssb基因表达显著下调。（5）依据微生物分析及p H指标,评估了Defensin及Def-a3对于冷却肉的防腐保鲜效果。结果表明Def-a3单独处理的冷却肉与对照组相比保鲜时间延长了一倍。而相比较于两种抗菌肽单独处理,Defensin与Nisin共同处理后,对冷却肉防腐保鲜效果有了很显著的提升,与等浓度的Def-a3对冷却肉的保鲜效果相当。Defensin和Def-a3抗菌肽的对人红血细胞的溶血活性都比较低。即使在较高浓度（100 umol/l）下,对人红血细胞的溶血活性不足1.5%。本研究在理论上将对有助于我们对于抗菌肽,尤其是昆虫防御素Defensin家族抗菌作用机理的认知;在应用上,可为将家蝇Defensin抗菌肽及其截短肽开发成为天然肽类防腐剂提供理论基础。
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