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原代培养时采取与同源生殖腺基质细胞共同培养的方式,继代培养时采用原代鼠胚成纤维细胞（primary mice embryonic fibroblast,PMEF）、原代鸡胚成纤维细胞（primary chicken embryonic fibroblast,PCEF）、STO细胞及SNL细胞为饲养层,以高糖DMEM添加2%鸡血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mML-谷氨酰胺,10mMHEPES（PH7.6）,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,10ng/mL庆大霉素,20ng/mL伴白蛋白,胎牛血清及细胞因子为培养基,以孵化4.5～7.5日龄（37.8℃、RH60%、600翻蛋角,每小时翻蛋1次）的鸡胚生殖腺为实验材料,探讨影响鸡原始生殖细胞（Primordial GermCells,PGCs）分离克隆胚胎生殖细胞（Embryonic Germ Cells,EG）的相关因素。实验结果如下: 1.根据Hamburger和Hamilton（1951）划分鸡胚发育阶段的标准,从孵化4.5～7.5日龄的鸡胚生殖腺中分离获取生殖腺PGCs,生殖腺组织用消化液（0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA）消化。用含10%FBS的DMEM中和消化液后,离心收集生殖腺细胞。用鸡胚胎生殖细胞（Chicken Embryonic GermCells,CEG）培养液稀释生殖腺细胞后,接种于24孔板中（细胞密度:4枚生殖腺/孔）,于CO2培养箱中培养（37℃,5%CO2,饱和湿度）,直至PGCs原代集落出现（大约2～3天）。培养至5～6天,集落边缘出现分化迹象,即应传代。用吸管轻轻将CEG细胞克隆吸出,消化液处理后, 200g离心5min,用CEG细胞培养液重悬细胞沉淀后,铺于PMEF饲养层上。平均5-6天对CEG细胞进行一次传代。 CEG细胞克隆的形态与小鼠的稍微不同;克隆内的细胞并不紧密堆积,高倍镜下观察能分辨出单个细胞。CEG细胞克隆并不紧密贴于饲养层细胞上,所以能够很容易地与饲养层细胞分离。CEG细胞类似于猪的ES或EG细胞,呈多层分布,克隆边界清晰。CEG细胞含有较大的核,较少的胞浆,核仁不明显。 2.CEG细胞分离与克隆时期的生长状况。CEG细胞培养12h时,就会出现10-15个PGCs组成的小集落,24h后集落较明显。培养至2-3天,出现鸟巢状的CEG细胞集落。可能由于含有相对多的杂细胞（如血细胞）的缘故,有些原代CEG细胞克隆呈红棕色。随着传代次数的增多,杂细胞的 1<WP=8>王娟:从原始生殖细胞中分离克隆鸡胚胎生殖细胞数量明显减少,集落内的细胞逐渐纯化,成为单一的CEG细胞。 3.胎牛血清对CEG细胞增殖能力的影响。把CEG细胞培养液中胎牛血清的浓度分别设为:0%、5%、10%、15%。结果发现:当胎牛血清为10%时CEG细胞的分离克隆效果最好。 4.细胞因子对CEG细胞分离克隆的影响。细胞因子添加与否对CEG细胞的分离及培养影响显著（p<0.05）。其中同时添加mLIF、bFGF、hSCF、IGF-1及h-IL-11时CEG的分离传代效果最好,五种因子的添加量分别为:1000IU/mL、10ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、0.04ng/mL。在实验中,添加复合因子时CEG细胞传代次数平均可达7.0,未添加任何细胞因子时仅为2.0。 5.不同饲养层细胞对CEG细胞分离增殖的影响。CEG细胞与生殖腺基质细胞共培养以及分别以经过丝裂霉素-C灭活过的PMEF、PCEF、STO及SNL细胞为饲养层共培养,比较发现:CEG细胞原代培养时采取与生殖腺基质细胞共培养的方式,生长效果最好;继代培养时以PMEF细胞为饲养层增殖能力最强。 6.鸡胚日龄对CEG细胞分离克隆的影响。分别从孵化4.5、5.5、6.5、7.5日龄的鸡胚生殖腺中分离培养PGCs,实验表明,鸡胚日龄对CEG细胞分离克隆的效果影响显著（p<0.05）;鸡胚日龄为5.5d时CEG细胞的克隆形成率和稳定传代率明显高于其它三种。 7.消化时间对CEG细胞生长行为的影响。CEG细胞继代培养时,采取4种方式进行传代操作,一组不用消化液,直接机械吹打;另外三组使用消化液,消化时间分别设为20s、40s、60s。比较发现,消化液添加与否以及消化时间的长短对CEG细胞的传代效果影响显著;传代时用消化液将CEG细胞克隆离散成小团块,CEG细胞的增殖速度最快;消化时间为40s时既能将CEG细胞之间的粘连打破,又不至于对细胞造成过度损伤。 8.分离得到的CEG细胞经AKP染色后呈蓝紫色,PAS染色后呈紫红色,而饲养层细胞不着色。在体外分化实验中,CEG细胞在无饲养层无分化抑制因子mLIF和h-IL-11时可以分化成几种细胞类型,包括成纤维细胞、神经细胞、自律细胞等。CEG细胞在悬浮培养时可以形成类胚体。本研究中得到了一只畸胎瘤鸡和一只嵌合体鸡。上述结果表明,本实验所获得的细 2<WP=9>山东农业大学硕士研究生论文（2004）胞具有EG细胞的诸多特性,为类EG细胞。