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第一部分血小板凋亡调控机制研究目的:血小板凋亡是调节血小板寿命和生存的机制,ITP患者血小板凋亡增多在ITP的发生中发挥重要作用,但发生凋亡的具体机制不明;蛋白激酶A在有核细胞中有促凋亡和促生存双重作用,PKA是否在ITP患者血小板凋亡中发挥作用,目前尚未有相关研究。本研究旨在探讨蛋白激酶A调节血小板凋亡在ITP发生中的作用及机制。方法:流式细胞术、Western blot检测血小板凋亡和活化;Western blot、ELISA法检测血小板PKA活性;免疫共沉淀检测PKA调控BAD与14-3-3和BCL-XL相互联系。结果:ITP患者血小板凋亡增多,PKA活性降低;ITP患者血浆诱导血小板凋亡增加,PKA活性下降;PKA抑制剂激活血小板内源凋亡途径引起血小板凋亡;PKA激动剂减少H89诱导的血小板凋亡;PKA调节BAD Ser155磷酸化水平;PKA通过改变BAD Ser155磷酸化状态调节血小板凋亡。结论:PKA参与调节ITP患者血小板凋亡过程;激活血小板PKA对治疗免疫性血小板减少症具有深远意义。第二部分PKA激活剂抑制凋亡及其临床应用价值研究目的:PKA激动剂可以抑制血小板凋亡及在体内的清除,为ITP的治疗提供新的策略。本研究旨在寻找合适PKA激动剂,在不影响血小板功能前提下能抑制血小板凋亡和在体内的清除,为进一步探讨PKA激动剂治疗ITP提供坚实的理论基础。方法:通过检测不同PKA激动剂的药物对抗体诱导血小板凋亡及对血小板聚集功能的影响,寻找合适的PKA激动剂;Western blot检测氨茶碱对PKA底物磷酸化改变;流式细胞术、Western blot检测氨茶碱对ITP血浆或血小板自身抗体诱导血小板凋亡的改变;抗体诱导小鼠ITP模型方法检测氨茶碱对血小板清除的影响;回输血小板方法检测氨茶碱对抗体诱导血小板清除的作用;不同浓度氨茶碱对多种诱导剂诱导血小板聚集的影响。临床研究氨茶碱在慢性ITP患者的安全性及疗效,以对目前一二线治疗无效的慢ITP为研究对象,拟入组60例慢ITP患者;干预方案为氨茶碱(100mg每日3次,口服)联合目前治疗,28天停氨茶碱,每周评估疗效及安全性。结果:我们发现氨茶碱并没有明显抑制血小板功能,但有抗血小板凋亡能力,氨茶碱是相对安全,价格便宜,治疗方便的特性,是比较理想的可以用于治疗ITP的PKA激动剂;氨茶碱浓度依赖抑制抗GPIbα抗体诱导血小板凋亡;氨茶碱抑制ITP血浆诱导的血小板凋亡;氨茶碱抑制抗体诱导血小板清除;氨茶碱抑制GPIbα抗体诱导血小板凋亡在小鼠体内清除;生理浓度的氨茶碱不影响血小板聚集功能。临床试验已经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准,并在中国临床试验注册中心注册,注册号为:Chi CTR-ONC-17013230,目前临床试验仍在进行中。结论:PKA激动剂抑制血小板细胞凋亡和在体内的清除,PKA激动剂(如氨茶碱)是ITP一种很有前景的治疗策略。