目的:遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症是由于凝血因子Ⅶ(FⅦ)基因(F7基因)先天性缺陷导致FⅦ功能减低,干扰外源性凝血途径的起始阶段,导致临床出血症状,该病为常染色体隐性遗传性疾病,由FⅦ基因(F7)突变导致。遗传性凝血FⅦ缺乏症以出血症状、凝血酶原时间延长而部分凝血活酶时间正常以及因子FⅦ活性降低为特点。纯合子者FⅦ活性较低,出血较重,新生儿期即可发病。该病发病率极低,在1/50万左右,男女均可发病。Alexander等在1951年首次报道,约18%患儿的双亲为近亲结婚。编码FⅦ蛋白的F7基因位于13号染色体长臂(13q34)紧靠凝血因子X基因上游2.8kb的位置,长度为12850bp,mRNA长3141 bp,cDNA长2462 bp,由9个外显子和8个内含子组成。FⅦ是依赖维生素K的单链糖蛋白,是由406个氨基酸残基组成的,在肝脏中合成,肾脏也可以储存和合成,FⅦ能被血循环中的纤维蛋白原及其降解产物刺激合成,分子量为45078,N端为γ-羧基谷氨酸残基,C末端为谷氨酸残基,系丝氨酸蛋白酶结构域,整个分子分4个结构域,从C末端起分别为一个催化区、两个表皮生长因子(EGF)区和γ-羧基谷氨酸残基。临床上根据FⅦ抗原和活性水平将遗传性FⅦ缺陷分为三类:交叉反应物质阳性(cross reacting material CRM+)、交叉反应物质阴性(CRM-)与交叉反应物质降低(CRMR)。该病的临床表现呈多样化,有的终生未出现出血表现,有的出现严重出血,甚至颅内出血,其基因突变类型与FⅦ活性、抗原水平与临床出血表现无明显相关性。目前,纳入人类基因突变数据库(2014年2月)的FⅦ相关突变有283种,突变类型有6种,包括错义、启动子、剪切位点、无义、小的插入和缺失突变,其中错义突变占70%,缺失突变占10%,剪切位点突变占9%,启动子突变占6%,其余为一些小的插入突变和无义突变。F7基因数据库的完善和新的遗传家系的发现,对该病遗传性的诊断、基因治疗及预后判断等具有重要意义。本研究对1例遗传性FⅦ缺陷症患者及其家系成员F7基因进行检测,观察基因突变与临床表型的关系,探讨其功能异常的分子机制。方法:1家系及临床资料先证者为20岁女性,为行扁桃体炎手术,于门诊查凝血常规时发现pt延长,体格检查:皮肤粘膜未见出血点及瘀斑,心肺腹无异常。平素体健,无明显出血倾向,无抗凝药物等应用史。实验室检查:血常规、肝功能、乙肝五项均正常。家系成员为患者父母,均无皮肤、牙龈出血或轻度外伤出血不止等出血倾向,父母非近亲婚配,无血缘关系。2标本采集:对患者及征得患者及其家属同意后,采集患者及其父母的外周静脉血标本,以0.109mol/l构橼酸钠按1:9抗凝,3000r/min离心后,分离血细胞和血浆,留取血浆,标本分成2份,-80℃保存,一份用于凝血指标检测;另一份用于基因组dna提取和pcr扩增。3血浆凝血指标检测:凝血酶原时间(pt)检测、活化部分凝血活酶时间(aptt)检测、纤维蛋白原(fg)以及凝血因子Ⅱ活性fⅡ、fⅤ、fⅦ、fⅩ活性检测。4引物设计:pcr及测序引物共12对,根据fⅦ基因序列(genbankj02933),应用primer5软件分别设计了12对引物以覆盖f7基因的所有9个外显子及侧翼、5’及3’非翻泽区序列。其中第8外显子采取分段扩增的方法,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。5pcr扩增:50ul的pcr反应体系包括:1uldna模板、上下游pcr引物各0.5ul、5ul25mmol/lmgcl2、1ul脱氧核糖核苷酸(dntps),1.5ultaqdna聚合酶、0.5ultap酶以及35.5ul水。pcr反应在verity96well进行,由美国abi生产。反应条件:变性30s。根据引物的不同分别55℃~60℃退火35s;72℃延伸40-50s,72℃修复延伸5-8min,共35个循环。1%琼脂糖电泳,150v、100ma电泳20min。6pcr产物的纯化和测序分析pcr产物割胶后送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化后测序,采用双脱氧链终止法在3730xl(abi生产)测序仪上进行测序,用chromas软件将测序结果与美国国立生物信息中心基因库所公布的j02933序列作为标准进行比对,找寻基因突变,对发现基因突变的序列进行反向测序证实。7分子模型的构建与分析:将此信号肽序列通过网上数据库http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/进行进一步功能预测,以此来推断其对该基因功能的影响。结果:1凝血指标的检测:与正常人相比,先证者的aptt正常,pt明显延长,fⅦ活性(fⅦ:c)显著下降,为1.1%,fⅤ:c、fⅡ:c及fⅩ:c基本在正常范围内,pt纠正试验显示能够被正常血浆完全纠正,除外凝血因子Ⅶ抑制物,提示为遗传性fⅦ减低。家系其他成员pt和aptt均正常,fⅦ:c为正常,其他凝血因子活性也在正常范围。2测序结果:患者及其家系成员的f7基因突变以美国ncbi基因库所公布的j02933序列为标准进行对比,我们发现:(1)先证者和父亲的f7基因第1a外显子第556位核苷酸出现杂合突变t/g,密码子ctg变为cgg,相应亮氨酸(l)变成精氨酸(r),即leu12arg,而先证者母亲无此突变;(2)先证者和父亲f7第5外显子8401位核苷酸发生c/t突变,cac变成cat,但对应的氨基酸均为组氨酸(h),属同义突变,而母亲无此突变,此为多态性;(3)先证者f7在3’非翻译区11814位存在插入突变,插入两个a,父母均未见此突变;(4)在3’非翻译区12432位出现g/a突变,此突变位于非翻译区,对翻译的终止和最终的外显子剪接有作用,先证者和父亲均存在此突变,而母亲未见此突变。3突变对蛋白功能影响的预测:由于患者f7基因中第556位发生了t/g杂合突变,导致该位点的氨基酸发生l12r的改变,此改变恰巧位于fⅦ蛋白信号肽的疏水区域,我们通过对fⅦ蛋白突变前后信号肽区整体及各区域的变化,发现由于l12r的改变,有可能对信号肽区不同区域的分割上有一定的影响,进而影响信号肽区正常功能的发挥,可能导致fⅦ蛋白最初翻译产物进入内质网的能力降低,致使成熟蛋白质的数量降低,最终引起fⅦ因子活性降低。结论:1f7基因突变纯合子或双重杂合子有不同程度的出血表现,而单纯杂合子几乎无临床症状。2首次发现1例f7基因l12r突变:先证者f7基因第1外显子第556位核苷酸发生t→g杂合性错义突变,导致信号肽区(即1a区)内的氨基酸发生L12R改变。功能影响预测分析发现此位点突变可能对信号肽区不同区域的分割上有一定的影响,进而影响了信号肽区正常功能的发挥,进而导致FⅦ蛋白最初翻译产物进入内质网的能力降低,最终造成成熟FⅦ蛋白的减少和活性的降低。