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超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)(EC.1.15.1.1)系一类金属酶,广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应,从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为Cu, Zn-SOD(存在于真核生物),Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物),Fe-SOD(存在于原核生物和高等植物的叶绿体中)等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似,可能起源于同一祖先。嗜热真菌产生的超氧化物歧化酶在高温条件下具有高活力和稳定性,并且与中温真菌一样,嗜热真菌产生的超氧化物歧化酶普遍含有多种类型的组分。嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长,而绝大多数的真核生物若长期暴露于40℃以上将无法存活。本研究中T. aurantiacus var. levisporus在含干酪素的培养基中培养产生超氧化物歧化酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的Cu, Zn-SOD。分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法和Sephacryl S-100凝胶过滤层析的方法,测定出本研究所获得的超氧化物歧化酶的分子量分别为16.8kDa和33.2kDa。证明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一种由相同的2个亚基所构成的蛋白质,同时对该酶进行理化性质的研究。T. aurantiacus var. levisporus Cu, Zn-SOD的N-端7个氨基酸序列为VKAVAVL,与其它已报道的Claviceps purpurea, Paecilomyces sinensis and Glomerella cingulata的Cu, Zn-SOD N-端氨基酸序列同源性较高,推测可能是一种新的Cu, Zn-SOD。根据T. aurantiacus var. levisporus Cu, Zn-SOD的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了该Cu, Zn-SOD的编码基因,其全长cDNA为705bp,包含一个由155个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为DQ497636。由核苷酸序列推导的相应N端氨基酸序列与测定的纯酶N端序列完全一致,成熟肽大小预测为16 kDa。将经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的Cu, Zn-SOD基因和原核表达载体pET-22b(+)进行连接,构建成原核表达载体pET/czsod,并转化大肠杆菌E. coli BL21。经IPTG诱导培养4～5h,目的蛋白得到大量表达,SDS-PAGE电泳检测,在约17 kDa处有一条明显的蛋白带,蛋白大小与从该SOD氨基酸序列估计的蛋白分子量相符;而空质粒pET-22b(+)转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生,可溶性分析结果显示,表达的蛋白以包涵体形式存在。同时根据真菌Mn-SOD同源保守序列设计简并引物,分析比较筛选设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了该Mn-SOD的编码基因,其全长cDNA为878bp,包含一个由231个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为EF428323。