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目的:探究β1,4半乳糖基转移酶-1(β1,4GalT-Ⅰ)和骨桥蛋白(OPN)在围着床期小鼠子宫内膜的表达规律;分析OPN和β1,4GalT-Ⅰ在人体子宫内膜的表达、定位情况;检测人OPN重组蛋白(rhOPN)在模拟着床期子宫内膜RL95-2细胞中对β1,4GalT-Ⅰ表达的影响;分析rhOPN蛋白调节β1,4GalT-Ⅰ表达时所涉及的相关通路分子;检测rhOPN蛋白和β1,4GalT-ⅠsiRNA分别调控体外胚胎着床模型中子宫内膜β1,4GalT-Ⅰ的表达和对胚胎与子宫内膜黏附的影响。
方法:建立小鼠早孕模型,收取围着床期妊娠小鼠(D1-D5)子宫内膜,分别提取子宫内膜蛋白和RNA,用Real-timePCR和Western-blot检测围着床期小鼠子宫内膜中β1,4GalT-Ⅰ和OPN的表达情况;采集临床增生期、分泌期子宫内膜标本,分析OPN和β1,4GalT-Ⅰ在人体子宫内膜的定位情况;采用人子宫内膜癌细胞(RL95-2)模拟着床前接受态子宫内膜,通过rhOPN蛋白刺激RL95-2细胞,采用Real-timePCR和Western-blot方法检测不同浓度、不同时间条件下rhOPN蛋白对β1,4GalT-Ⅰ表达的影响,并确定最佳rhOPN作用条件(时间,浓度);在最佳条件下,检测参与rhOPN蛋白对β1,4GalT-Ⅰ调控表达的相关信号通路,并采用相关信号分子的特异性抑制剂,通过Real-timePCR和Western-blot方法检验相关信号通路;利用人源的绒毛癌细胞(JAR)模拟胚泡与RL95-2细胞组成体外着床模型,用β1,4GalT-ⅠsiRNA干扰RL95-2细胞中β1,4GalT-Ⅰ的表达,通过活细胞荧光标记JAR细胞,分别通过荧光显微镜和流式细胞计数分析β1,4GalT-Ⅰ表达下调后,rhOPN蛋白对RL95-2细胞和JAR细胞间黏附的影响。
结果:在围着床期小鼠(D1-D5)子宫内膜中,OPN和β1,4GalT-Ⅰ在蛋白和RNA水平的表达呈现一致性,D1-D4逐渐升高,在妊娠第4天(D4;着床窗口期)达到峰值,然后在孕D5下降。
免疫组织化学结果显示,OPN和β1,4GalT-Ⅰ在人子宫内膜组织腺体周围表达,且分泌期表达强于增生期。
不同浓度,不同时间条件下,rhOPN蛋白刺激RL95-2细胞表达β1,4GalT-Ⅰ逐渐增强,在200ng/ml、2h时β1,4GalT-Ⅰ的表达最强;选择rhOPN最佳作用条件,检测参与增强β1,4GalT-Ⅰ表达的相关信号通路分子,发现在rhOPN蛋白刺激下,Erk1/2、AKT(thr308)、p38的活化和IκBα的降解均增强;分别加入以上4种通路分子的特异性抑制剂后发现当Erk1/2、AKT、NF-κB的活性受到抑制时,rhOPN蛋白对β1,4GalT-Ⅰ的表达上调作用均受到不同程度的抑制,而抑制p38活性时,rhOPN蛋白对β1,4GalT-Ⅰ的表达并无影响;
在体外细胞黏附实验中,与未处理组相比,rhOPN蛋白能够提高RL95-2细胞对JAR细胞的黏附率。当用β1,4GalT-ⅠsiRNA下调RL95-2细胞中β1,4GalT-Ⅰ的表达后,JAR细胞在RL95-2细胞上的粘附率下降。下调β1,4GalT-Ⅰ后再加入rhOPN蛋白,JAR细胞的黏附率升高且与未处理组相比无明显差别。
结论:β1,4GalT-Ⅰ和OPN在围着床期小鼠子宫内膜的表达相似性,且均在分泌期子宫内膜腺体中高表达,提示β1,4GalT-Ⅰ和OPN共同参与了胚胎着床的过程;
OPN可能通过活化Erk1/2,AKT(thr308)和降解IκBα来调节β1,4GalT-Ⅰ的表达;
OPN可能通过调节β1,4GalT-Ⅰ的表达来参与调控JAR细胞和RL95-2细胞间的黏附。