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由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori.Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的血液型脓病是一种急性传染病,一旦感染,就会给养蚕业造成巨大损失。培育抗性品种和筛选抗性基因是蚕业研究工作者不断探讨的课题。本实验以研究室育成的对BmNPV有高抗性的家蚕品种和常规品种为素材,对感染病毒后家蚕抗性品种和常规品种中中肠组织的转录组数据进行分析,获得可能参与家蚕抗病毒机制中的差异基因。以筛选出的家蚕促海藻糖转运因子样(Bombyx mori facilitated trehalose transporter Tret1-like,BmTret1-like)基因为研究对象,对其进行基因克隆及基因表达分析,通过RNAi技术初步探讨BmTret1-like基因与家蚕抗病毒的关系。主要研究结果如下:1、BmNPV侵染家蚕中肠组织转录组分析我们以家蚕抗性品种BYN和常规品种BY中肠组织为材料构建文库,共得到12.82Gb Clean Date(BY品种得到6.40Gb Clean Date,BYN品种得到6.42Gb Clean Date),样品Q30碱基百分比均不小于86.03%。将Clean Date与参考基因组序列比对,可得到序列在参考基因组中的位置信息及样品特有的序列信息。在识别单碱基错配,查找潜在单核苷酸多态性位点时样品BY比对出57 789个SNP位点,BYN比对出58725个SNP位点,2个文库中SNP位点分布在基因区的比例达到60%以上。将Mapped Reads拼接后与原基因组注释信息比较,共发掘出788个新基因。在BmNPV侵染家蚕后蚕体内参与抗病机理调节的基因较多。在筛选到的496个差异表达基因中,244个基因发生上调,252个基因发生下调,其中有486个基因被注释。对unigenes进行GO分类分析可知属细胞组件中细胞和细胞膜占主要部分;属生物进程中代谢过程、单组织进程、细胞进程和生物调节所包含的基因较多;属分子功能中具有催化活性和结合功能的基因数目较多。KEGG信号通路分析可知有142个基因被注释。在COG数据库分析中发现差异表达基因主要与氨基酸、碳水化合物、无机离子的代谢与运输有关。家蚕感染BmNPV病毒后体内出现复杂的基因表达调控,有多条通路参与抗病毒机制的调节。在与参考基因比对中有大部分基因被定位在单一通路上,这些基因的特征及其抗病机理的影响需要进一步研究。2、家蚕BmTret1-like基因的克隆及表达分析通过家蚕抗性品种BYN和常规品种BY中肠组织克隆BmTret1-like基因,扩增得到1272bp片段。将该基因与家蚕基因组中的同源序列比较可以看出其同源基因在染色体中分布并不均匀,主要分布在27连锁群上的最多。将该基因与其他物种构建系统发生树可以看出BmTret1-like基因与白纹伊蚊、火红蚁、红鳍东方鲀及意蜂亲缘关系较近,与黑腹果蝇、秀隐线虫等亲缘关系较远。BmTret1-like基因在家蚕各个组织中均表达,没有表现出组织特异性。在中肠组织中,添加病毒后蚕体内BmTret1-like基因表达量都有所下调;在脂肪体组织中,添加病毒后蚕体内BmTret1-like基因在抗性品种和非抗品种中表现出不同的调节趋势,在非抗性品种中除12h时间点外均表现出上调趋势,而抗性品种中都表现出下调趋势。3、利用RNAi实验初步探索BmTret1-like基因功能根据已知片段设计合成BmTret1-like基因的dsRNA,用带有荧光基团的BV病毒穿刺抗性品种及常规品种,其中抗性品种一组注射dsRNA,一组直接穿刺病毒。结果被RNAi的抗性品种中观察到荧光,只穿刺病毒的抗性品种中未观察到荧光,常规品种中荧光效果明显。这说明对BmTret1-like基因RNAi后家蚕体内的抗病毒机制受到影响,说明BmTret1-like基因确实参与家蚕抗病毒机制的调节。