喹噁啉-N1,N4-二氧化物早期作为抗菌药应用于兽医临床。近些年研究表明,喹噁啉类化合物具有广泛的药理活性,如抗肿瘤、抗病毒、抗结核杆菌、抗虫及抗真菌活性。特别是针对抗结核杆菌和抗原虫活性的新型喹噁啉类化合物的发现及结构改造成为药物化学领域研究的热点之一。研究表明喹噁啉类化合物在生物体内氧化还原酶的作用下产生氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）,ROS进攻细菌DNA双链造成DNA双链发生断裂,最终导致细菌死亡。喹噁啉类化合物具有较强的厌氧选择活性,其在还原性酶的作用下,得到一个单电子被还原,并释放出羟基自由基（OH·）。OH·是生物体内的一种ROS,它能够通过修饰DNA双链进而降解DNA,这也是目前研究所得到的最为认可的喹噁啉类化合物的作用方式。对喹噁啉类化合物抗结核杆菌活性的研究较为广泛,但对其抗结核杆菌的作用机制研究较少。目前基于结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）作用机制的研究主要集中在巨噬细胞内各种通路的调控作用,其中包括ROS和自噬。ROS可以进攻M.tb细胞膜上的电子传递链（Electron transport chain,ETC）,干扰其能量代谢及稳态;高水平的ROS也能诱导细胞自噬,通过自噬可以抑制并清除胞内感染的M.tb。本课题首先运用药效团融合的药物设计策略,保留喹噁啉-N1,N4-二氧化物药效团,分别重点对喹噁啉环C2位和C6位进行结构改造,获得新型喹噁啉-N1,N4-二氧化物衍生物。对获得的目标化合物进行抗菌活性评价,建立构效关系。然后从ROS、DNA合成与修复以及诱导细胞自噬等方面阐明喹噁啉-N1,N4-二氧化物发挥抗菌作用的作用方式。1.新型噻唑烷酮-喹噁啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究本课题拟通过结构改造得到新型喹噁啉-N1,N4-二氧化物,完善该类化合物的构效关系,并筛选出潜在的先导化合物为喹噁啉类化合物研究与发展奠定基础。研究表明喹噁啉环的C2和C7位取代基对该类化合物的抗菌活性影响较大,并且本实验室前期也对该类化合物的构效关系进行了分析,同样发现C2位取代基对其抗菌活性影响较大。近些年来,化合物的结构改造主要借助药效团融合、化合物骨架跃迁和电子等排等方法,从而获得具有潜在活性的先导化合物。噻唑酮环广谱的抗菌活性为本课题化合物的设计改造提供了思路,本课题采用药效团融合的策略设计了C2位含有不同取代噻唑酮环的化合物,在经过氧化反应、Beirut反应、水解反应、醛胺缩合及环化缩合反应后得到26个新型噻唑烷酮-喹噁啉-N1,N4-二氧化物（TZN1～26）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物TZN1～26的抗菌、抗真菌和抗结核杆菌活性,结果表明:TZN4、TZN5、TZN10、TZN11、TZN15、TZN16、TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对革兰氏阳性菌表现出显著的抗菌活性,较喹乙醇抗菌活性提高2～8倍,如化合物TZN20和TZN21对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC为16μg/m L。化合物TZN19-26对白色念珠菌（C.albicans,ATCC90028）、热带念珠菌（C.tropicalis,ATCC7349）,A.fumigatus（3.5352）和C.neoformans（2.3201）具有一定的抗菌活性（MIC≤8μg/m L）。TZN20、TZN21、TZN25和TZN26对M.tb具有显著的活性（MIC=1.56μg/m L）。分析后发现,在喹噁啉环C7位或苯环C4位引入F原子或Cl原子后能增加化合物活性,当取代甲基或甲氧基后会明显降低化合物活性。通过建立3D-QSAR模型分析化合物的构效关系。结果表明,在喹噁啉环C7位和苯环的C4位取代体积大、电负性强或亲水性基团有利于提高喹噁啉类化合物的抗菌活性;在喹噁啉环C7位引入正电性基团会显著降低化合物的亲和力,导致化合物抗菌活性的降低;在喹噁啉环C2位侧链引入亲水性基团和氢键供体基团同样会提高化合物的抗菌活性。2.新型含氮杂环-喹噁啉-N1,N4-二氧化物的设计、合成与活性研究目前对喹噁啉环C6位的结构改造较少,仅有少量研究表明在C6位引入卤素原子或甲基基团可以提高化合物的抗菌活性,未见更多的结构改造,导致该位置构效关系的空缺。本课题采用药效团融合策略重点针对C6位进行结构改造,引入多种含氮杂环,同时在C2位取代酯基或酰基,C3位引入甲基或三氟甲基,C7位取代氟原子,在经过一系列氧化反应、Beirut反应及亲核取代反应后得到33个新型含氮杂环-喹噁啉-N1,N4-二氧化物（NCH1～33）。采用微量肉汤稀释法和MABA法分别测定化合物NCH1～33的抗菌活性和抗结核杆菌活性,结果显示:化合物NCH1～33对大肠杆菌ATCC25922的抗菌活性较差,仅NCH5、NCH6和NCH25的MIC值为4～8μg/m L;化合物NCH16、NCH20、NCH24、NCH28和NCH29对耐药大肠杆菌的抗菌活性与标准菌相比,并未有明显降低的现象,说明耐药大肠杆菌对这些化合物并未产生明显的耐药性,也间接表明喹噁啉类化合物的抗菌作用方式可能与氟喹诺酮类药物有所差异。NCH1～33对胸膜肺炎放线杆菌ATCC27090的MIC低至0.25μg/m L,对副猪嗜血杆菌HPS0165的MIC低至1μg/m L。对于金黄色葡萄球菌ATCC29213,化合物的MIC低至0.5μg/m L,较乙酰甲喹抗菌活性提高256倍。对于临床分离耐药金葡菌,化合物的MIC低至1μg/m L;化合物对MRSA的MIC值低至4μg/m L。化合物NCH16、NCH20、NCH28和NCH29对M.tb具有显著的抗菌活性,MIC≤0.25μg/m L,与乙酰甲喹相比活性提高了16～32倍。化合物NCH29在不同浓度下与M.tb感染的巨噬细胞孵育不同时间均表现出显著的胞内抗菌活性,在40×MIC浓度时与细胞孵育4 d后可以减少2.73-log数值的胞内M.tb;当不同浓度的NCH29与细胞孵育1 d后,胞内M.tb表现出0.1～1.69-log数值的降低。分析后发现,当喹噁啉环C2位乙酯或苄酯取代时,化合物抗菌活性较高;C3位引入-CF3后发现可以增加化合物的活性;C6位咪唑或1,2,4-三氮唑取代时,化合物抗菌活性较高;C7位引入氟原子显著增加化合物的活性,尤其当C6位引入官能团后,C7位须有氟原子取代才可以起到提升化合物抗菌活性的作用。3D-QSAR结果表明,在喹噁啉环C6位增加取代基的电负性,可以提高化合物的活性;C6位取代亲水性基团、C3位取代疏水性基团能够增加化合物的活性;在C2/C6位置的侧链基团,应该考虑具有更多氢键供体的基团。3.喹噁啉类化合物抗菌作用机制研究对大肠杆菌作用机制研究基于文献调研和前期研究结果,本课题对喹噁啉类化合物的作用机制做出假设:喹噁啉类化合物通过自身产生的ROS对细菌的DNA造成损伤;同时它还能干扰细菌对损伤的DNA修复的过程,从而进一步发挥抗菌作用。选取DNA合成与修复相关的酶,主要包括DNA聚合酶I、DNA连接酶和DNA拓扑异构酶（DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶IV）等,通过对上述蛋白酶进行活性抑制试验阐明喹噁啉类化合物与DNA损伤修复系统之间的联系,结果表明:（1）喹噁啉类化合物对DNA连接酶和DNA拓扑异构酶无明显的抑制作用;（2）对DNA聚合酶I表现出显著的抑制活性,如喹多辛和替拉扎明在128μg/m L时对DNA聚合酶I的抑制率分别为80.2%和78.7%;（3）与底物d NTPs同时竞争酶的活性中心,并且能够抑制酶活性,且N-O键是化合物发挥作用的必要结构。上述结果可以初步确定喹噁啉类化合物通过抑制DNA聚合酶I的活性发挥作用。对结核杆菌作用机制研究首先测定了喹噁啉类化合物对M.tb能量稳态的影响,分别通过膜完整性试验、ATP消耗试验和RT-q PCR评估喹噁啉类化合物对M.tb能量稳态的影响。结果显示:NCH29处理M.tb后,细胞膜完整性受到破坏、菌体内ATP水平显著降低并且II型NADH脱氢酶（Type II NADH-dehydrogenase,NDH-2）相关m RNA（ndh和ndh A）的表达水平显著下调。上述结果表明,NCH29与M.tb作用后,造成细胞膜的损伤和破坏,使菌体无法维持稳态平衡以及自身生存;NCH29能够继续作用于ETC,干扰NDH-2功能的正常发挥,破坏菌体的氧化还原稳态,阻碍电子在ETC的正常传递,造成菌体内ATP水平显著下调,能量稳态受到破坏,导致M.tb的死亡。为研究喹噁啉类化合物作用于巨噬细胞后对M.tb的抗菌作用机制,本课题分别通过多功能酶标仪检测胞内ROS及线粒体超氧自由基的变化,自噬相关蛋白LC3 II的变化则由WB和共聚焦显微镜进行测定。结果表明,NCH29能够刺激M.tb感染的巨噬细胞内ROS水平的增加,并且ROS水平与化合物浓度和孵育时间呈正相关的关系;NCH29处理M.tb感染的细胞后可以诱导细胞自噬的发生,并且可以在胞内观察到大量自噬体标志物的堆积。上述结果表明,当NCH29作用于M.tb感染的巨噬细胞后,一方面可以刺激巨噬细胞产生大量的ROS,ROS进攻胞内的M.tb,起到杀菌作用;另一方面,高水平的ROS也可以诱导巨噬细胞自噬的发生,通过自噬这一生物过程清除胞内的M.tb,进一步发挥抗菌作用。综上所述,本课题设计合成了59个新型喹噁啉-N1,N4-二氧化物,并对其抗菌活性进行评价。采用3D-QSAR建立了新型喹噁啉-N1,N4-二氧化物抗菌活性的构效关系。本研究结果表明喹噁啉类化合物不仅可以通过ROS破坏细菌DNA双链,还可以抑制DNA聚合酶I的活性、干扰细菌能量稳态、诱导细胞自噬发挥抗菌作用。本课题深入研究了喹噁啉类化合物的抗菌作用机制并建立了构效关系,为进一步的喹噁啉类药物设计与改造提供了科学依据。