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研究目的:采用盲肠结扎穿孔（CLP）的方法复制小鼠脓毒症动物模型,免疫磁珠分离脓毒症小鼠脾调节性T细胞（Treg）及效应T细胞（Teff）,通过检测调节性T细胞对效应T细胞增殖能力和凋亡的影响,分析调节性T细胞在脓毒症免疫抑制发生中的作用。方法:（1）模型制备:实验小鼠为健康清洁级雄性BALB/c小鼠,8～10周龄,体重20±2g,30只,随即分为盲肠结扎穿孔（CLP）模型组及假手术（Sham）组,各15只。术前12h禁食水。氯胺酮:速眠新（2∶1混合,0.05ml/只）腹腔注射（i.p）麻醉。常规消毒腹部,无菌条件下取腹正中切口,打开腹腔寻找盲肠,盲肠结扎穿孔（CLP）组在盲肠远端回盲瓣下1/2处用无菌4号丝线结扎,盲肠远段中央处12号针头贯通穿刺两次,略加挤压出少量粪便涂于盲肠表面,然后把盲肠推回腹腔,关闭腹腔,逐层缝合;假手术（Sham）组仅开腹游离盲肠,外置1～1.5min后还纳。术后按1 ml/只皮下注射生理盐水,补充手术中丢失的体液。观测术后72h生存率。（2）细胞分离、共培养:术后24h颈椎脱臼处死小鼠取脾,分离单个核细胞,免疫磁珠两步分选法分离CD4+CD25+调节T细胞（Treg）及CD4+CD25-效应T细胞（Teff）,CFSE标记CD4+CD25-效应T细胞,将分离所得细胞按以下分组配组:1.Treg;2.Teff;3.Treg+Teff（1∶1）24孔板共培养;4.Treg+Teff（1∶1）Transwell培养组,T 35℃,CO25%条件下培养60h。（3）流式细胞仪检测:CFSE标记效应T细胞,培养60h后,流式细胞仪检测效应T细胞的增殖;在此基础上,Annexin V-APC和7-AAD标记,流式细胞仪检测效应T细胞凋亡。结果:（1）术后模型评价:假手术（Sham）组小鼠术后正常活动、进食、进水,术后72h生存率为100%;盲肠结扎穿孔（CLP）模型组小鼠术后出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、活动差、怕冷、聚居、竖毛、厌食、眼角分泌物增多、腹泻等表现,术后72h生存率为66.7%。（2）调节性T细胞对效应T细胞增殖的影响:流式细胞仪检测结果显示效应T细胞与调节性T细胞共培养,CFSE标记效应T细胞所占比例,CLP组为（54.89±2.97）%,Sham组为（73.60±2.10）%,CLP组CFSE标记的效应T细胞所占比例比Sham组低,差异存在统计学意义（P＜0.05）,表明,脓毒症条件下调节性T细胞对效应T细胞增殖抑制作用明显提高。Transwell培养,CFSE标记的效应T细胞所占比例CLP组为（92.01±1.74）%,Sham组为（93.25±1.27）%,Transwell培养组的两组细胞与共培养的两组细胞比较,效应T细胞所占比例明显提高（p＜0.05）;并且CLP组及Sham组Transwell培养的两种细胞,CFSE标记的效应T细胞所占比例,二者间差异没有统计学意义（p＞0.05）,表明调节性T细胞抑制作用的发挥有赖于与效应T细胞的直接接触。（3）调节性T细胞对效应T细胞凋亡的影响:流式细胞仪检测结果显示效应T细胞与调节性T细胞共培养组,效应T细胞凋亡率,CLP是（38.13±2.55）%;Sham组是（15.36±2.42）%,CLP组效应T细胞的凋亡明显比Sham组高（P＜0.05）,差异存在统计学意义（P＜0.05）。表明,脓毒症条件下调节性T细胞诱导效应T细胞凋亡作用明显提高。Transwell培养,效应T细胞凋亡率,CLP组是（0.36±0.12）%,Sham组是（0.35±0.13）%。Transwell培养的两组细胞与共培养的两组细胞比较,效应T细胞的凋亡率明显下降,并且CLP组及Sham组Transwell培养的两种细胞,效应T细胞凋亡率,二者间差异没有统计学意义（p＞0.05）。表明调节性T细胞诱导效应T细胞凋亡作用的发挥有赖于与效应T细胞的直接接触。结论:（1）应用盲肠结扎穿孔法建立脓毒症动物模型,通过对术后一般情况、生存率的观察,确认模型可靠。采取目前较多应用的两步法免疫磁性分离系统分离CD4+CD25+调节性T细胞,所得细胞纯度较高,细胞活力无影响,完全可以满足进一步实验的要求。（2） CLP组调节性T细胞对效应T细胞增殖的抑制效应明显高于Sham组,Transwell实验使调节性T细胞对效应T细胞的抑制效应丧失,表明脓毒症过程中调节性T细胞抑制效应明显增强,并且抑制效应表现为细胞-细胞接触依赖机制。（3） CLP组调节性T细胞诱导效应T细胞的凋亡作用高于Sham组,Transwell实验使调节性T细胞诱导效应T细胞的凋亡效应丧失,表明在脓毒症过程中,调节性T细胞诱导效应T细胞凋亡的作用明显增强,并且诱导凋亡效应也表现为细胞-细胞接触依赖机制。